وبلاگ

برای بررسی خاصیت ضد اکسیدانی عصاره­های گیاهی، مقایسه نتایج به دست آمده از این عصاره­ها، با مواد ضد اکسیدان استاندارد، امری ضروری است. یکی از این مواد استاندارد بوتیل هیدروکسی تولوئن می­باشد.

غلظت‌های ۱، ۸/۰، ۵/۰، ۲۵/۰، ۱/۰، ۰۵/۰،۰ ۰۰۵/۰، ۰۰۰۵/۰و ۰۰۰۰۵/۰ میلی گرم بر میلی لیتر در ۸ عدد بالن ژوژه ۱۰ میلی لیتر تهیه گردید. سپس ۸ عدد بالن ژوژه ۵ میلی لیتر هم تهیه شد که ۱ میلی لیتر از هر کدام از این محلول­ها را به درون بالن­ها انتقال یافت. بعد ۱ میلی لیتر از محلول DPPH تهیه شده به این بالن­ها اضافه شد. همچنین در یک بالن ۵ میلی‌لیتر دیگر ۱ میلی لیتر متانول و ۱ میلی لیتر از DPPH به عنوان شاهد اضافه گردید. پس از ۳۰ دقیقه، محلول‌های با غلظت ضد اکسیدان بیشتر در اثر احیا از بنفش به زرد تغییر رنگ پیدا کرد. سپس جذب هر کدام از محلول­ها را با صفر کردن توسط محلول متناظر، در طول موج ۵۱۷ نانو متر با دستگاه UV/Vis خوانده شد. برای خواندن جذب محلول شاهد از متانول مرک به عنوان استاندارد برای صفر کردن دستگاه استفاده شد. پس از محاسبه درصد مهار برای هر غلظت طبق رابطه مذکور در قسمت بعدی، نمودار درصد مهار بر حسب منفی لگاریتم غلظت (میلی گرم بر میلی لیتر) رسم شد.
ب) عصاره‌های گیاهی : از عصاره‌های گیاهی به­‌طور مجزا یک غلظت پایه تهیه شد به این ترتیب که ۲۵ میلی‌گرم از هر عصاره به‌طور جداگانه توزین شد ودریک بالن ژوژه ۲۵ میلی لیتر با متانول به حجم رسانده شد. پس ازتهیه محلول پایه برای عصاره چند غلظت رقیق­تر هم طبق غلظت هایی که در مورد BHT گفته شد تهیه گردید. تهیه محلول­های عصاره از محلول پایه به روش رقیق سازی متوالی انجام شد. به ۱ میلی لیتر از هر محلول عصاره ۱ میلی لیتر از محلول DPPHاضافه شد. محلول­های شاهد وعصاره به مدت نیم ساعت در فضای تاریک نگه داری شد ودر طول این مدت مقداری تکان داده شد تا محلول­ها کاملاً همگن شوند. جذب هریک از این محلول ها با دستگاه UV/Vis در طول موج ۵۱۷ نانومتر قرائت شد. درهرمرحله از خواندن جذب به شاهدی برای صفر کردن دستگاه لازم است که حاوی مواد شیمیایی یکسان با آن ( حلال و نمونه گیاهی ) وفاقد رادیکال آزاد DPPH است. در صد مهار با فرمول زیر محاسبه شد:
در این فرمول ^A_blank و ^A_sample به ترتیب میزان جذب شاهد ونمونه می باشند . مقدار IC₅₀ نشان دهنده غلظتی از ترکیب است که موجب ۵۰% بازدارندگی در ظرفیت رادیکالی می‌گردد سپس منحنی درصد مهار برحسب منفی لگاریتم غلظت رسم شد و با کمک آن IC₅₀ قابل محاسبه است. (این آزمون سه مرتبه تکرار شد).
در مورد گیاه Physospermum cornubiense (L.) DC. همه غلظت های عصاره گیاهی سر شاخه ۲ برابر شده تا درصد مهار غلیظ ترین محلول بیشتر از ۹۰٪ باشد.

۲-۵-۲- اندازه‌گیری مقدار کل ترکیبات فنلی

برای اندازه گیری مقدار کل ترکیبات فنلی از روش فولین- سیکالتو و گالیک اسید به عنوان استاندارد استفاده شد .
تهیه محلول ۲% سدیم کربنات : میزان ۷/۲ گرم از سدیم کربنات در بالن ژوژه ۵۰ میلی لیتری با آب تقطیر شده به حجم رسید .
تهیه محلول شاهد : ۲/۰ سی سی حلال DMSO، یک میلی لیتر معرف فولین سیوکالتو وپس از گذر سه دقیقه زمان، ۳ میلی لیتر محلول سدیم کربنات ۲% به بالن ژوژه ۵۰ میلی لیتری منتقل و با آب مقطر به حجم رسید.
محلول‌های استاندارد گالیک‌اسید: محلول‌هایی از گالیک‌اسید با غلظت‌های ۱، ۲، ۳، ۴، ۵، ۶، ۷، ۸، ۹ و۱۰ میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تهیه شد. ۱/۰میلی‌لیتر از هریک از محلول‌ها به بالن‌های۵۰ میلی‌لیتری حاوی آب مقطر افزوده شد. سپس به همه بالن‌ها ۱میلی‌لیتر معرف فولین‌سیوکالتو اضافه شد. بعد از ۳ دقیقه، ۳ میلی‌لیتر محلول سدیم‌کربنات %۲ افزوده و بالن‌ها با آب مقطر به حجم رسانده شد و به مدت ۲ ساعت در محیط آزمایشگاه نگه داشته شد.
تهیه محلول از عصاره : میزان ۱۰ میلی گرم از عصاره مورد نظر به طور دقیق با ترازوی آنالیتیکی وزن و در لوله آزمایش ریخته شد سپس میزان ۲ میلی لیتر حلال DMSO به آن افزوده و در اثر هم زدن پیوسته با همزن ارتعاشی حل گردید .
سه نمونه از عصاره در سه بالن ژوژه۵۰ میلی لیتری با مشخصات ذیل تهیه گردید.
میزان ۲/۰ میلی لیتر از محلول عصاره را برداشته وداخل بالن ژوژه ۵۰ میلی لیتر ریخته و بر روی آن حدود ۳۵ میلی لیتر آب مقطر اضافه نموده وسپس ۱ میلی لیتر از معرف فولین- سیکالتو افزوده و به خوبی مخلوط گردید . بعد از ۳ دقیقه، ۳ میلی لیتر از محلول سدیم کربنات ۲% افزوده و با آب مقطر به حجم ۵۰ میلی لیتر رسید. محلول‌ها به مدت ۲ ساعت در دمای آزمایشگاه نگه داشته شد. در طول این مدت مقداری تکان داده شد تا محلول‌ها کاملاً همگن شوند پس از صفرکردن جذب با محلول شاهد جذب هریک از محلول‌ها بادستگاه اسپکتروفتومتر در طول موج ۷۶۰ نانومتر قرائت شد .
با بهره گرفتن از جذب‌های به دست آمده از محلول‌های استاندارد گالیک‌اسید، نمودار جذب- غلظت رسم شد و معادله خط آن محاسبه گردید. با قراردادن مقدار جذب عصاره‌ها در این معادله، مقدار معادل گالیک اسید ترکیب های فنلی گیاه به دست آمد. مقدار کل ترکیب های فنلی هم ارز با وزن گالیک اسید در عصاره گیاه، از طریق معادله خط منحنی کالیبراسیون زیر به صورت محاسباتی قابل تعیین است .
Absorbance = 0012/0 × Gallic acid (µg/mg) 0033/0 +

۲-۵-۳- آزمایش بی‌رنگ شدن بتاکاروتن در حضور لینولئیک‌اسید

الف. برای انجام این آزمایش ابتدا محلول­های زیر تهیه شد.
میزان ۲۵۰ میلی لیتر آب مقطر در ارلن ریخته و جریان مداومی از گاز اکسیژن به مدت ۱ ساعت همراه با اختلاط به داخل آن وارد شد تا از اکسیژن اشباع شود.
مقدار ۲۰ میلی‌گرم از هر یک از نمونه­ها در ۱۰ میلی لیتر دی متیل سولفوکسید حل گردید.
مقدار ۲۰ میلی‌گرم از شاهد مثبت BHT در ۱۰ میلی لیتر دی متیل سولفوکسید حل گردید.
مقدار ۷/۵ میلی گرم بتاکاروتن در یک بالن ژوژه ۱۰ میلی لیتر ریخته و با کلروفرم (HPLC grade) به حجم رسانده شد.
مقدار ۳۸/۵۶ میلی گرم لینولئیک اسید در بالن ژوژه ۵ میلی لیتر ریخته و با کلروفرم به حجم رسانده شد.
بالن‌اول: مقدار ۳۰۰ میلی گرم توئین ۴۰ در بالن ۲۵۰ میلی لیتر و بالن‌دوم : مقدار۲۰۰ میلی گرم توئین ۴۰ در بالن ۲۵۰ میلی لیتر دیگر ریخته شد.
ب. تهیه محلول­های نهایی و انجام آزمایش
به بالن اول مقدار ۳ میلی لیتر و به بالن دوم مقدار ۲ میلی لیتر از محلول شماره ۵ اضافه شد.همچنین به بالن اول حاوی توئین مقدار ۵/۱ میلی لیتر از محلول شماره ۴ اضافه شد.
با بهره گرفتن از تبخیر کننده دوار حلال کلروفرم موجود در هر دو بالن تبخیر و به بالن اول ۱۵۰ میلی لیتر و به بالن دوم ۱۰۰ میلی لیتر از آب مقطر اشباع از اکسیژن اضافه و خوب مخلوط شد.
برای هریک از نمونه­ها، شاهد مثبت وشاهد منفی ۳ عدد لوله آزمایش هرکدام حاوی مقدار ۳۵۰ میکرولیتر از نمونه­ها (محلول شماره الف-۲)، شاهد مثبت (محلول شماره الف-۳) و شاهد منفی (حلال مورد استفاده برای تهیه نمونه­ها) تهیه گردید. همچنین برای هر یک از نمونه­ها، شاهد مثبت و شاهد منفی یک لوله آزمایش حاوی مقدار ۷۰۰ میکرولیتر از نمونه­ها (محلول شماره ۲)، شاهد مثبت (محلول شماره ۳) و شاهد منفی (حلال مورد استفاده برای تهیه نمونه­ها) تهیه شد (محلول­های شاهد). به سری ۳ تایی لوله­ها مقدار ۵/۲ میلی لیتر از محلول بالن ۲۵۰ میلی لیتر اول و به سری یک تایی مقدار ۵ میلی لیتر از محلول بالن ۲۵۰ میلی لیتر دوم اضافه گردید.
قبل از افزودن محلول (۴-الف) به لوله‌های آزمایش عصاره‌ها و شاهد مثبت، این محلول به لوله‌های شاهد منفی افزوده و پس از ۲ ساعت ماندن در دمای ۵۰ درجه سانتی‌گراد، اسپکتروفتومتر (UV-Vis) با سری یکتایی محلول‌های شاهد منفی در طول موج ۴۷۰ نانومتر صفر و جذب سری سه تایی شاهد منفی در این طول موج سه بار خوانده شد. میانگین جذب­ها در طول موج نام برده باید بین ۴/۰ -۳/۰ به دست آید.
تمامی نمونه­ها و شاهدهای مثبت و منفی به مدت ۲ ساعت در دمای ۵۰ درجه سانتیگراد نگه داری شدند. پس از این مدت دستگاه را هر بار با محلول­های موجود در لوله­های تکی مربوط به نمونه­ها، شاهد مثبت و منفی در طول موج ۴۷۰ نانومتر صفر نموده و جذب مجموعه­های سه تایی نمونه­ها و شاهدهای مثبت و منفی در این طول موج خوانده شد و با بهره گرفتن از رابطه ذیل درصد مهار لینولئیک ‌اسید محاسبه ‌گردید.