وبلاگ

 

EcoRI (units/µl10)

۵

 

آب دیونیزه

۱۶۰

 

 

جدول ۲-۱۸ واکنش هضم آنزیمی pHan-gcsf-zeocin با EcoRI
۲-۷-۵-۲ الکتروپوریشن سلول های هانسونلا پلی مورفا

 

 

• ابتدا میزان مناسبی از کلنی تازه رشد یافته مخمر را به درون ml200 محیط کشت مایع YPD تلقیح نموده و محیط را بر روی شیکر در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد گرماگذاری میکنیم تا جذب نوری محیط در طول موج ۶۰۰ نانومتر (OD600nm) به ۲/۱-۸/۰ برسد.

 

 

 

• محیط کشت فوق را در rpm5000 به مدت ۵ دقیقه سانتریفوژ نموده و به میزان ۲/۰ برابر، بافر فسفات پتاسیم mM50 ولرم (C°۳۷( با ۵/۷pH و سپس DTT 1مولار با غلظت نهایی mM25 به آن اضافه نمایید.

 

 

 

• سلولها را به مدت ۱۵ دقیقه در دمای C°۳۷ قرار می دهیم.

 

 

 

• سلول ها را با سانتریفوژ در rpm5000 به مدت ۵ دقیقه جمع آوری نموده و دو بار با بافر STM (پیوست ۷) درحالیکه سلولها بر روی یخ قرار دارند شستشو می دهیم (بار اول به صورت هم حجم و در مرحله دوم با نصف حجم اولیه).

 

 

 

• رسوب سلولی نهایی را در ۰۰۵/۰ حجم اولیه از بافر STM حل کرده و این سوسپانسیون سلولی مستعد را در حجم های کم در دمای C°۷۰- نگهداری میکنیم.

 

 

 

• به منظور ترانسفورم نمودن سلولهای مستعد، سوسپانسیون های سلولی (حجم µl60) را بر روی یخ ذوب نموده و µg10- ng200 از مولکول DNA خطی شده را به آن اضافه میکنیم.

 

 

 

• سپس سلولها به کووت الکتروپوریشن ۲ میلی متری سرد منتقل می شوند.

 

 

 

• بعد از خشک نمودن کووت آن را درون دستگاه الکتروپوریشن قرار داده و به آن پالسی با مشخصات ۲ کیلوولت، ۲۵ میکروفاراد و ۲۰۰ اهم وارد مینماییم.

 

 

 

• بلافاصله پس از وارد نمودن پالس، ml1 محیط کشت YPD به تیوب حاوی سلولها اضافه کرده و به مدت ۱ساعت در دمای °C 37 در شیکر انکوباتور قرار می دهیم.

 

 

 

• محیط را سانتریفوژ نموده (rpm5000, 5دقیقه( و سلولها را بر روی محیط کشت YPD جامد حاوی زئوسین با غلظت µg/ml400 کشت داده و به مدت ۵-۳ روز در دمای °C37 قرار میدهیم.

 

 

 

• سلولهای رشد یافته در غلظت بالای زئوسین (µg/ml400)، به صورت ماتریکس بر روی پلیت حاوی ۸۰۰ و سپس µg/ml1600 کشت داده شدند.

 

 

 

• • پس از گذشت مدت زمان لازم (۳ روز) از کلونهای رشد یافته برای انجام PCR اختصاصی ژنهای کلون شده در وکتور بیانی استفاده گردید.

 

 

۲-۷-۵-۳ تأیید کلونهای نوترکیب هانسونلا با روش Colony PCR اختصاصی ژن زئوسین
PCR اختصاصی ژن زئوسین بر روی کلونهای نوترکیب رشد یافته در مراحل قبل بر اساس پروتوکل ۲-۷-۳-۱ و جدول ۲-۱۳ انجام گردید.
۲-۷-۶ بیان پروتئینGCSF در هانسونلا پلی مورفا
۲-۷-۶-۱ کشت سلولهای مخمری

 

 

• سلول مخمری تأیید شده با PCR ژن زئوسین و نیز سلول مخمری فاقد پلاسمید در ml5 محیط کشت BMGY (پیوست ۱) کشت داده شده و بر روی شیکر در دمای С °۳۰ با دور rpm200 قرار داده شد تا OD600 محیط به ۶-۲ برسد (حدود ۱۸-۱۶ ساعت).

 

 

 

• محیط کشت فوق را در g3000 به مدت ۵ دقیقه سانتریفوژ نمودیم.

 

 

 

• رسوب سلولی را در ۳۰ میلی لیتر محیط BMMY (پیوست ۱)، اختصاصی جهت بیان پروتئین های نوترکیب با اتانول حل نموده و مجدداً برای ادامه رشد در انکوباتور قرار دادیم.

 

 

 

• پس از گذشت ۲۴ ساعت، از متانول ۱۰۰% به غلظت نهایی ۵/۰% به محیط اضافه نمودیم تا بیان پروتئین القاء گردد.

 

 

 

• پس از گذشت مدت زمان ۹۶ ساعت از شروع کشت، محیط بیانی را در دور rpm6000 به مدت ۵ دقیقه سانتریفوز مینماییم.

 

 

 

• محلول رویی را به تیوب جدید منتقل نموده و پس از اندازه گیری غلظت پروتئینی در ۲۸۰ نانومتر، اقدام به تغلیظ این محلول به منظور بررسی با SDS-PAGE می نماییم.

 

 

 

• محلول فوق را با عبور از فیلترهای Centriprep YM50 بر طبق دستورالعمل شرکت سازنده تغلیظ می نماییم.

 

 

۲-۷-۶-۲ بررسی بیان پروتئین نوترکیب با روش SDS-PAGE

 

 

• ژل SDS-PAGE 15% بر اساس روش ذکر شده در بخش۲-۶-۱۰ تهیه گردید.

 

 

 

• پس از انجام الکتروفورز و رنگ آمیزی ژل، میزان بیان پروتئین نوترکیب با روش کوماسی بلو بر اساس شدت باند حاصله مورد بررسی قرار گرفت.

 

 

۲-۷-۷ تزریق نمونه پروتئینی به خرگوش
تولید آنتی بادی پلی کلونال به روشهایی برای معرفی یک ایمونوژن به حیوان و خونگیری برای سنجش میزان آنتی بادی نیاز دارد. انتخاب حیوان بستگی به امکانات موجود در نگهداری حیوان، میزان آنتی سرم مورد نیاز و میزان ایمونوژن موجود، دارد. پاسخ ایمنی بهتر، عموماً زمانی بدست می آید که از یک ادجوان مناسب در اولین ایمنی زایی استفاده گردد. برای این منظور، ایمونوژن بصورت یک امولسیون آب و روغن آماده می شود که حاوی میکوباکتریوم کشته شده با حرارت می باشد که تحت عنوان آدجوان کامل فروند معرفی می گردد. استفاده از این امولسیون فرد را مطمئن می کند که آنتی ژن به آرامی در جریان خون حیوان آزاد می شود و از طرفی باکتریهای کشته شده میکوباکتریوم، سیستم ایمنی حیوان را تحریک می کنند. ایمن سازی های بعدی، برای افزایش سطح آنتی بادی لازم اند و در بافر فسفات سالین (PBS) یا در امولسیون روغنی (ادجوان ناقص فروند ) مصرف می شوند (Johnstone, 1996).
روش های مختلفی برای تزریق ایمونوژن وجود دارد (Johnstone, 1996) که عبارتند از :