وبلاگ

بدون تردید، ابداع و معرفی واکنش زنجیره­ای پلی مراز (PCR) بیشترین نقش را در توسعه و تکامل نشانگرهای DNA داشته است. واکنش زنجیره­ای پلی­مراز یک روش سریع تکثیر آزمایشگاهی قطعه یا قطعه­های مورد نظر DNA است و نشانگرهای DNA را از نظر وابستگی به انجام PCR به دو دسته نشانگرهای DNA مبتنی بر PCR و نشانگرهای غیر مبتنی بر PCR تقسیم بندی می­نمایند.

۱-۳-۱۲-۱- نشانگرهای ریزماهواره

ریز ماهواره­ها توالی‌هایی از DNA هستند که شامل واحدهای کوتاه پشت سر هم تکرار شونده از ۱ تا ۶ جفت باز (bp) در طول DNA می باشند. معمولاً طول ردیف­های تکرار­شونده بین ۲۰ و در مواردی تا ۱۰۰ جفت باز بوده است و توسط دو ردیف منحصر به فرد در دو طرف محدود شده ­اند (لو و همکاران، ۲۰۰۳). برخی منابع تعداد واحدهای کوتاه تکرار شونده در ریزماهواره­ها را ۱ تا ۴ و حداکثر تا ۱۵۰ جفت باز اعلام نموده ­اند (نف و گروس، ۲۰۰۱). ریزماهواره­ها به سه گروه عمده تکرارهای کامل، تکرارهای ناکامل (معمولا توسط بازهای غیر تکرارشونده قطع می­شوند) و تکرارهای مرکب (دو یا تعداد بیشتری از واحدهای تکراری مجاور یکدیگر) تقسیم می­شوند. حداقل تعداد واحد تکرارشونده برای ریزماهواره­های دو نوکلئوتیدی و سه نوکلئوتیدی به ترتیب ۱۰ و هفت بار تکرار تعیین شده­است. ریزماهواره­ها یا ردیف­های تکراری ساده (SSR) گروهی از ردیف­های تکرارشونده­اند که با نام­های مختلف همچون تفاوت طول ردیف­های ساده^[۱۳] (SSLPs)، ردیف­های کوتاه تکراری^[۱۴] (STRs)، موتیف­های با ردیف ساده^[۱۵] (SSMs) و نقاط ریزماهواره نشان­مند از ردیف^[۱۶] (STMs) نیز خوانده می­شوند. ردیف­های ریزماهواره­ای غیرپایدارند و با کاهش یا افزایش واحدهای تکرارشونده دچار تغییرات فراوان در طول می­شوند. تنوع در تعداد تکرارهای ریزماهواره­ها که به کمک PCR و الکتروفورز قابل آشکار سازی­اند، موجب شده است که از ریزماهواره­ها به عنوان ابزار مولکولی با پتانسیل بسیار زیاد برای تشخیص­های ژنومی در آزمایشگاه­ها استفاده شود. فراوانی ردیف­های کوتاه تکرار شونده در ژنوم سازواره­های مختلف، اعم از یوکاریوت­ها و تاحدی پروکاریوت­ها به اثبات رسیده است. این ریزماهواره­ها با روش­های پیچیده زیست­شناسی مولکولی و با هزینه زیاد شناسایی و ردیف­های مجاور آن­ها تعیین می­شوند. سپس براساس ردیف احاطه کننده هر ریزماهواره آغازگرها طراحی و ساخته می­ شود. از طریق واکنش زنجیره­ای پلی­مراز و با بهره گرفتن از این گونه آغازگرها می‌توان DNA ژنومی نمونه­های مختلف را برای تکثیر ریزماهواره­های مذکور مورد استفاده قرار داد (نقوی و همکاران، ۱۳۸۶).

۱-۱-۳-۱۲-۱- مزایای ریزماهواره­ها

الف- کاربرد آن­ها و تفسیر نتایج نسبتا ساده است؛
ب- سیستم چند آللی از ویژگی­های بارز این نشانگر است؛
ج- ریزماهواره­ها بسیار متنوع­اند؛
د- به وفور در ژنوم یوکاریوت­ها یافت می­شوند؛
ه- بیشتر ریزماهواره­ها غیر عملکردی^[۱۷] هستند؛
و- همبارز هستند، یعنی هر دو آلل قابل تشخیص می­باشند (لی و همکاران، ۲۰۰۷).

۲-۱-۳-۱۲-۱- معایب ریزماهواره­ها

الف- شناسایی ریزماهواره­ها، تعیین ردیف بازی آن­ها، طراحی و ساخت آغازگرها و تهیه نقشه ژنتیک ریزماهواره­ها که مقدمه کاربرد این نشانگرهاست، بسیار پیچیده و مستلزم صرف وقت و هزینه بسیار زیاد است؛
ب- در صورت توزیع نامناسب ریزماهواره­ها در طول ژنوم کاربرد مؤثر آن­ها در مکان‌یابی ژن­ها محدود می­گردد؛
ج- کمبود تعداد ریزماهواره­های شناخته شده در برخی از موجودات استفاده از آن­ها را در مکان یابی ژن­ها محدود کرده است (نقوی و همکاران، ۱۳۸۶).

۱۳-۱- سنجش فراوانی آللی

جمعیت را می­توان به­عنوان خزانه­ای از آلل­ها در نظر گرفت. فراوانی آللی عبارت است از محاسباتی که طی آن مشخص می­کنیم یک آلل فراوان یا نادر بوده و در چند درصد از یک جمعیت حضور دارد. در یک سیستم دو آللی فراوانی آلل غالب (A) را با p و فراوانی آلل مغلوب (a) را با q نشان می­دهیم. بنابرین چون فقط دو آلل وجود دارد در نتیجه ۱p+q=. اگرچه یک فرد دیپلوئید در هر جایگاه تنها دارای دو آلل است ولی در یک جمعیت ممکن است آلل­های متفاوت دیگری برای آن جایگاه وجود داشته باشد. محاسبه فراوانی آلل­ها در مطالعات ژنتیک جمعیت ضروری است. فراوانی ژنوتیپی که تحت عنوان نسبت حضور هر یک از ژنوتیپ­ها در یک جمعیت تعریف می­ شود نیز باید معادل ۱ باشد. یعنی فراوانی حضور ژنوتیپ­ها (AA، Aa، aa) باید مساوی ۱ باشد. محاسبه فراوانی آللی با بهره گرفتن از رابطه زیر محاسبه می­ شود:
P = 2H_{o +} H_e / ۲N
که H_o = تعداد افراد هموزیگوت‌ها برای آن آلل، H_e = تعداد هتروزیگوت‌ها برای آلل و N = تعداد نمونه‌های رتبه‌بندی شده در لکوس است.
در صورت عدم وجود عوامل برهم زننده تعادل اجزای مدل هاردی- واینبرگ، فراوانی آللی از یک نسل به نسل دیگر ثابت باقی می­ماند. پیش ­بینی فراوانی­های ژنوتیپی براساس مدل هاردی- واینبرگ تنها زمانی امکان­ پذیر است که افراد دارای آمیزش تصادفی بوده و والدین سهم یکسانی در به اشتراک گذاشتن گامت­ها داشته باشند و ترکیب گامت­ها نیز به­ صورت تصادفی انجام شود. در ماهیان و سایر آبزیان معمولاً نمونه­برداری در افراد بالغ صورت می­گیرد. گزینش و مهاجرت دو عامل مهم ایجاد انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ در جمعیت بالغ ماهیان و آبزیان هستند. علاوه بر این گونه­ های نادر ماهیان و سایر آبزیان به­ صورت نسل­های مجزا از هم زندگی می­نمایند و اغلب جمعیت­ها، ترکیبی از افراد نسل­های مختلف هستند که با یکدیگر هم­پوشانی دارند (ملکیان، ۱۳۸۹).

۱۴-۱- تغییر فراوانی آللی

چنانچه در یک جمعیت تعادل هاردی- واینبرگ برقرار باشد؛ فراونی­های آللی از یک نسل به نسل دیگر (بوسیله گزینش یا مهاجرت) تغییر نخواهد کرد؛ ولی تحت تأثیر عاملی به نام شانس، فراوانی آللی می ­تواند تفاوت­هایی را بین نسل­های مختلف نشان دهد. در شرایط طبیعی بر­خلاف پیش ­بینی­های آماری، تعداد گامت­های تولیدی توسط افراد با ژنوتیپ­های مختلف، متفاوت خواهد بود و احتمال ترکیب تصادفی برای همه گامت­ها نیز وجود ندارد. بنابراین در هر نسلی انحرافاتی از موازنه هاردی- واینبرگ دیده می­ شود که به این تغییرات زیستی رانش ژنتیکی تصادفی^[۱۸] نیز گفته می­­شود. واریانس فراوانی آللی با بهره گرفتن از رابطه زیر محاسبه می­ شود:
واریانس فراوانی آلل = p (1-p) / 2N_e
p فراوانی آلل و N_e اندازه جمعیت موثر است. اندازه مؤثر جمعیت به افرادی از جمعیت گفته می‌شود که از نظر ژنتیکی بر نسل بعدی تأثیر­گذار هستند. به عبارت دیگر افرادی از جمعیت که نابالغ یا آنقدر پیر هستند که قادر به تولید مثل نیستند و یا افرادی که گامت­های غیر طبیعی تولید می­نمایند، جزء جمعیت مؤثر محسوب نمی­گردند. این افراد ممکن است دارای گامت­های غیر­قابل بارور بوده و یا به دلیل زیست در مناطق جغرافیایی متفاوت و یا اختلاف در زمان تخم­ریزی، امکان آمیزش آن­ها با سایر افراد جمعیت وجود ندارد. اندازه جمعیت مؤثر باعث کاهش واریانس فراوانی آللی و اندازه کوچک جمعیت مؤثر باعث افزایش واریانس فراوانی آللی می­ شود. به عبارت دیگر در جمعیت­های کوچک نوسانات طبیعی در فراوانی آللی از نسلی به نسل دیگر بسیار شدیدتر است (کیوان­شکوه و درافشان، ۱۳۸۹).

۱۵-۱- موازنه هاردی- واینبرگ و دلایل انحراف از آن

براساس مدل هاردی- واینبرگ، جمعیتی از یک موجود دیپلوئید با تولید مثل جنسی که در یک جایگاه دارای آلل­های A با فراوانی p و B با فراوانی q باشند، با فرض آمیزش تصادفی میان افراد، پس از یک نسل فراوانی­های ژنوتیپ­های AA، AB و BB به ترتیب برابر با P²، pq2 و q² خواهد بود. این مدل را می­توان در مواردی که بیش از دو آلل وجود دارد نیز تعمیم داد. در این مدل فراوانی هر ژنوتیپ هموزایگوت دو برابر حاصل ضرب فراوانی­های دو آلل است. برای تعیین مطابقت آماری مجموعه ­ای از داده ­ها با مدل هاردی- واینبرگ می­توان از آزمون کای مربع استفاده نمود. موازنه هاردی- واینبرگ بر پایه یک سری از فرضیه ­ها استوار است که گرچه این فرض­ها دقیق و سخت‌گیرانه به­نظر می­رسد اما جمعیت­های بزرگ که برون آمیزی دارند از این موازنه پیروی می­ کنند چرا که اثر جهش و گزینش در آن­ها اندک است. اگر ما بتوانیم فراوانی هر یک از آلل­ها را به­دست آوریم می­توانیم فراوانی حضور ژنوتیپ­ها را نیز در جمعیت پیش ­بینی کنیم.
هنگامی که یک جمعیت از موازنه پیروی نمی­کند محققان سعی می­ کنند تا بفهمند چرا این گونه است. چراکه عدم پیروی از این موازنه می ­تواند نکات جالبی را در مورد ماهیت لوکوس مورد مطالعه (مثلا اثر انتخاب طبیعی) و یا جمعیت مورد مطالعه (مثلا درون آمیزی) به ما نشان دهد. بنابراین باید مظمعن شویم که نتایج حاصل به­ دلیل خطای انسانی نیست. به­عنوان مثال نمونه­برداری نامناسب از جمعیت می ­تواند منجر به عدم تطابق با موازنه مذکور شود. حالت ایده آل اندازه یک نمونه حداقل ۳۰ تا ۴۰ فرد از یک جمعیت است. در ذیل مهم­ترین عوامل ایجاد انحراف از تعادل آورده شده است:
۱- گزینش: میزان مرگ و میر متفاوت افرادی که دارای یک ژنوتیپ و یا یک نوع آلل خاص بوده و یا این که دارای یک نوع گامت خاص هستند، در گزینش آن­ها دخالت خواهد داشت. بسته به این که چه ژنوتیپ یا ژنوتیپ­هایی شایسته­ترین حالات ممکن هستند، انواع مختلف گزینش شامل غالبیت (Dominance)، فوق غالبیت (Over-dominance)، نیمه غالبیت (Semi-dominance) و تحت غالبیت (Under-dominance) بروز می­ کند.
۲- آمیزش غیر تصادفی: این مورد می ­تواند به صورت­های مختلفی روی دهد؛
- درون آمیزی (Inbreeding): آمیزش میان خویشاوندان را درون آمیزی می­نامند که می ­تواند نتیجه عدم پراکنش مناسب افراد باشد. درون آمیزی سبب افزایش افراد خالص و کاهش افراد ناخالص می‌شود.
- آمیزش همسان پسندانه (Assortive mating): به حالتی اطلاق می­ شود که در آن احتمال آمیزش بین افرادی که ژنوتیپ یا فنوتیپ یکسان دارند، بیشتر است.
- آمیزش ناهمسان پسندانه (Disassortive mating): در این روش، احتمال آمیزش بین افراد ناهمسان بیشتر از افراد همسان است.
۳- مهاجرت: مهاجرت گروهی از افراد جمعیت به درون جمعیت دیگر که دارای فراوانی آللی متفاوت بوده و به واسطه عوامل جغرافیایی یا متفاوت بودن زمان تخم ریزی از هم جدا شده ­اند، منجر به انحراف از حالت تعادل هاردی- واینبرگ می­ شود. این حالت اثر Wahlund نامیده می­ شود که موجب افزایش تعداد افراد خالص می­گردد.
۴- آلل­های پوچ (Null alleles): آلل­های پوچ در واقع منجر به انحراف از تعادل هاردی- واینبرگ نمی­شوند، اما می­توانند این تصور را ایجاد نمایند که تعادل برقرار نبوده و انحراف وجود دارد. هنگامی که بنا به دلایلی یک آلل همبارز مشاهده نمی­ شود، به آن آلل پوچ می­گویند. عدم تظاهر یک آلل در هنگام تعیین ژنوتیپ­ها منجر به بروز اشتباه خواهد شد، زیراکه ژنوتیپ­های ناخالص میان یک آلل قابل رؤیت و یک آلل پوچ به عنوان ژنوتیپ خالص محسوب می­شوند. این موضوع منجر به افزایش تعداد افراد خالص و انحراف از مدل هاردی- واینبرگ خواهد شد. آلل­های پوچ در ریزماهواره­ها در نتیجه وقوع جهش در یکی از نقاط آغازگر و عدم تولید محصول PCR پدید می­آیند (رضایی و همکاران، ۲۰۱۱).

۱۶-۱- آماره F

شاید بتوان گفت که متداول­ترین روش برای کمی کردن تفاوت­های ژنتیکی بین جمعیت­ها بر پایه استفاده از متغیرهای آماری F استوار است که در سال ۱۹۵۱ توسط رایت^[۱۹] ابداع شد. متغیرهای آماری ^[۲۰]F از ضریب درون آمیزی برای محاسبه تفاوت­های ژنتیکی و بررسی چگونگی تقسیم این تنوع ژنتیکی بین گروه­ ها در سه سطح مختلف استفاده می­ کنند. ترتیب ارائه این پارامترها در اینجا براساس روش متداول در منابعی است که زیربنای تئوری متغیرهای F را پدید آورده­اند. اولین متغیر آماری F_IS است (I^[21] بیانگر افراد و S^[22] بیانگر زیرجمعیت است) که میزان درون آمیزی بین افراد خویشاوند را نسبت به سایر افراد جمعیت محاسبه می­ کند. در حقیقت این پارامتر احتمال این که دو آلل در یک فرد آلل­هایی متمایز باشند که از یک جد مشترک مشتق شده ­اند را اندازه می­گیرد که همانند ضریب درون‌آمیزی (F) است. F_IS را توسط رابطه زیر به­دست می­آوریم:
F_IS= H_S - H_L/H_S
در این معادله H_L عبارت از هتروزیگوسیتی مشاهده شده در یک زیر­جمعیت در زمان مطالعه (هتروزیگوسیتی افراد) و H_S میزان هتروزیگوسیتی مورد انتظار (هتروزیگوسیتی زیر­جمعیت) است در شرایطی که داده ­ها از موازنه هاردی- واینبرگ پیروی می­ کنند.
دومین متغیر آماری F که تحت عنوان شاخص تثبیت نیز شناخته می­ شود F_ST (T^[23] بیانگر کل جمعیت است) است. با بهره گرفتن از این شاخص میزان تفاوت­های ژنتیکی بین زیر­جمعیت­ها را برآورد می­ کنند. در حقیقت این شاخص میزان درون­آمیزی یک زیر­جمعیت را در مقایسه با کل جمعیت (شامل همه زیر­جمعیت­ها) می­سنجد و احتمال این که دو آلل بر­حسب تصادف از داخل یک جمعیت خارج شده و هر دو شاخص تبار­شناختی آن باشند را نشان می­دهد. F_ST را به­ صورت زیر محاسبه می­کنیم:
F_ST= H_T -H_S /H_T
H_S در این معادله مقدار هتروزیگوسیتی زیر­جمعیت و H_T مقدار قابل پیش ­بینی هتروزیگوسیتی کل جمعیت است. F_IT سومین متغیر آماری F است که برآوردی کلی از میزان درون­آمیزی در یک جمعیت را با محاسبه هتروزیگوسیتی افراد نسبت به کل جمعیت به­دست می ­آورد. بنابراین عدم وجود تولید مثل تصادفی در جمعیت و همچنین تقسیم شدگی جمعیت به زیر­جمعیت­ها بر مقدار F_IT تأثیر می‌گذارد. محاسبه F_IT به شکل زیر است:
F_IT= H_T - H_I/H_T
رابطه سه متغیر بیان شده به­ صورت زیر می­باشد:
F_IT= F_IS + F_ST – (F_IS)(F_ST)

۱۷-۱- فاصله ژنتیکی^[۲۴] (Nei, 1978)

یک راه محاسبه شباهت ژنتیکی دو جمعیت برآورد فاصله ژنتیکی بین آن­هاست. راه­های متعددی برای اندازه ­گیری فاصله ژنتیکی وجود دارد که یکی از متداول­ترین آن­ها فرمول نئی است که تحت عنوان فاصه ژنتیکی استاندارد (D) نامیده می­ شود. برای محاسبه آن ابتدا باید پارامتر شباهت ژنتیکی (I) که آن نیز توسط نئی ارائه شده است را بشناسیم (نئی، ۱۹۷۸). این پارامتر در حقیقت شباهت­های ژنتیکی جمعیت­ها را نشان می­دهد. برای یک لوکوس مشخص، I را به طریق زیر به­دست آوریم:
I=
در این معادله عبارت است از فراوانی آلل i در جمعیت x، عبارت است از فراوانی آلل i در جمعیت y و m تعداد آلل­ها در هر لوکوس. مقدار I بین صفر و یک متغیر است و هنگامی که آن را محاسبه کردیم می­توانیم فاصله ژنتیکی را با بهره گرفتن از رابطه زیر به­دست آوریم: