Rinsing buffer : محلول شستشو باید قبل از مصر به صورت تازه ساخته شود برای هر نوار ۴۰mL محلول شستشو استفاده می‌شود.
Substrate/chrowogen sdution :
محلول سوبسترا به صورت آماده در کیت وجود دارد.
روش اجرایی آزمون الایزا
۱-نمونه‌ها محلول‌های مورد استفاده در آزمون طبق دستور العمل‌ها ساخته می‌شود.
۲- ۱۰۰MLاز sam ple dliution buffer: در خانه‌های دوتایی H1 ، H2 می‌ریزیم که این خانه‌ها حاوی نمونه کنترل منفی می‌باشد.
Sample ditution buffer 5 در خانه های دوتایی A2 و A1 می‌ریزیم که این خانه‌ها حاوی نمونه‌هایی کنترل مثبت می‌باشد.
از هر محلول استاندارد در باقی خانه به صورت دوتایی می ریزیم B1 تا I1 که به ترتیب شامل ۰٫۰۶۲۵ ، ۰٫۱۲۵ ، ۰٫۲۵ ، ۰٫۵ ، ۱٫۵ و می‌باشد.
۴- از محلول کونژوگه به تمام خانه ها اضافه می‌شود به غیر از خانه های H2 و H1
۵-پلیت حاوی محلول ها را به روی یک شیکر گذاشته و برای دقایقی آن را به خوبی مخلوط می‌کنیم.
۶-پلیت را برای ۱ ساعت در مای ۲۵°c تا ۲۰°c در یک محل تاریک انکوبه می کنیم.
۷- محتویات داخل پلیت را خالی کرده و ۳ بار آن را با محلول شستشو می شویم.
۸- از محلول سوبسترا به تمام خانه ها اضافه می کنیم.
۹-پلیت را برای ۳۰ دقیقه در دمای ۲۵°c تا ۲۰°c در یک محل تاریک انکوبه می کنیم.
۱۰- از محلول stop را به تمام خانه ها اضافه می کنیم.
۱۱-به سرعت پلیت را به وسیله دستگاه Elisa Reader در محلول موج ۴۵۰nm می‌خوانیم.
۱۲-توسط نرم افزار OD های بدست آمدره را محاسبه کرده.
روش شستشو
در این آزمون بین هر مرحله باید محتویات داخل پلیت باید شسته شود.
۱-محتویات داخل پلیت را با برگرداندن آن خالی کرده و با کوبیدن پلیت بر روی یک دستمال تمیز آن را کاملاً تخلیه می کنیم.
۲-تمام خانه های استفاده شده را با از محلول شستشو پر می کنیم.
۳-این عمل ۳ بار باید انجام شود.
۴-پلیت را با کوبیدن بر روی یک دستمال تمیز کاملاً خشک می کنیم.
۵- باید توجه داشت که تمام خانه ها به طور کامل خشک شده و قطره ایی از محلول شستشو باقی نمانده باشد.
بررسی باقیمانده کلرامفنیکل با روش ایمونواسی
روش آماده‌سازی نمونه‌ها
شیر:
نمونه‌های برای آزمایش به صورت مستقیم باید به نسبت ۱ به ۴ با sample dilution buffer رقیق شود.
روش مستقیم: برای انجام این آزمون به صورت مستقیم باید چربی شیر به صورت دائمی گرفته شود و گرنه باعث مخدوش شدن جواب آزمون می‌شود.
دیگر فاکتور تأثیرگذاری برروی آزمون PH نمونه‌ها شیر است. شیری که PH اسیدی دارد باعث به وجود آمدن خطا در آزمون می‌شود.
شیر سرد را برای ۱۵ دقیقه در دور۲۰۰۰ در دمای ۴ درجه سانتگیراد.سانتریفیوژ می کنیم. فاز بالایی محلول را که چربی شیر می‌باشد را با کاردک جمع می‌کنیم. شیر بدون چربی را با نسبت ۱ به ۴ با sample dilution buffer رقیق می‌کنیم.
sample dilution buffer را به ۱۰۰ میکرولیتر شیر اضافه می‌کنیم ۵۰ میکرولیتر آن را برای آزمون استفاده می‌کنیم.
تخم مرغ:
۱ گرم از یک تخم مرغ کاملاً یک دست و یکنواخت را به یک لوله تمیز انتقال می‌دهیم ۶ mlاتیل استات به آن اضافه کرده و آن را به مدت ۱ دقیقه کاملاً مخلوط می‌کنیم. هنگامی که آن را به شدت مخلوط کنیم محلول مورد نظر تبدیل به یک ژله می‌شود. بعد آن را به مدت ۱۰ دقیقه دردور ۲۰۰۰ سانتریفیوژ می کنیم.۳ ml از لایۀ رویی را به یک لوله تمیز منتقل می‌کنیم.
محتویات لوله را در ۵۰ درجه سانتیگراد زیر بخار نیتروژن تبخیر می‌کنیم به چربی باقیمانده ۱mlاِن هگزان و ۰/۵ ml با sample dilution buffer اضافه می‌کنیم و آن را به مدت ۱ دقیقه مخلوط می‌کنیم و بعد آن را به مدت ۱۰ دقیقه در دور۲۰۰۰ سانتریفیوژ می‌کنیم. سپس لوله را به مدت ۵ دقیقه در حمام آب گرم در دمای °۸۰ می‌گذاریم و سپس دوباره سانتریفیوژ می‌کنیم. ۵۰ میکرولیتر از لایۀ زیرین از محلول را برای آزمون اصلی بر می‌داریم.
گوشت:
استخراج به وسیله اتیل استات صورت می‌گیرد. ابتدا باید به صورت کامل گوشت چرخ شود و به یک مخلوط همگن تبدیل شود۳gr از مخلوط را برداشته و به یک لوله تمیز منتقل می‌کنیم و ۶ml اتیل استات به آن اضافه می‌کنیم و به مدت ۱۰ دقیقه آن را مخلوط می‌کنیم. سپس آن را به مدت ۱۰ دقیقه در دور ۲۰۰۰ سانتریفیوژ می‌کنیم ۴ml از محلول رویی را برداشته، و به یک لوله تمیز دیگر منتقل می‌کنیم و سپس در دمای ۵۰ درجه سانتیگراد زیر بخار نیتروژن آن را تبخیر می‌کنیم.
به چربی باقی مانده ۱ml اِن هگزان و۱ml sample dilution buffer اضافه کرده و بعد آن را به مدت ۱ دقیقه به شدت مخلوط می‌کنیم و سپس به مدت ۱۰ دقیقه آن را سانتریفیوژ کرده سپس لوله را به مدت ۵ دقیقه در یک حمام آب گرم در دمای ۸۰ درجه سانتیگراد گذاشته. لوله مورد نظر با محتویات داخل آن سانتریفیوژ کرد، و ۵۰ از مایع زیرین را برداشته و برای آزمون اصلی از آن استفاده می‌شود.
ر وش آماده سازی محلول های مورد استفاده در آزمون
از تمام مواد و محلول‌های داخل کیت می‌توان برای یک پلیت ۹۶ خانه‌ای استفاده کرد از هر استاندارد و نمونه باید به صورت دوتایی برای آزمون استفاده کرد.
Micro titre plate : نوارهایی که برای آزمایش قابل استفاده نیستند به سرعت باید داخل یخچال برگردانده شود اما نوارهایی که باید برای آزمایش استفاده شود باید به دمای محیط برسند.
Rinsing buffer : محلول شستشو باید قبل از مصرف به صورت تازه ساخته شود برای هر نوار ۴۰mL محلول شستشو استفاده می‌شود.
substrate: محلول سوبسترا به صورت آماده در کیت وجود دارد.
Conjugate : ویال لیوفیلیزه را با ۴ml از با reconstitution/zerostandard buffer مخلوط کرده و آن را در یک محل تاریک نگه می‌داریم.
antibody : ویال لیوفیلیزه را با ۴ml از reconst itution /zero standard buffer مخلوط کرده و در یک محل تاریک نگه می‌داریم.
sample dilution buffer : این بافریی که در کیت وجود دارد ۴ بار غلیظ شده است بنابراین قبل از مصرف باید با آب مقطر رقیق شود. ۲۰ml از بافر باید با ۴۰ml از آب مقطر رقیق شود. باید قبل از مصرف به دمای اتاق رسیده کاملاً به هم زده شود.
Standard (100ng/ml) : برای ساخت رقت‌های استاندارد باید از محلول استانداری که حاوی ۱۰۰ng/ml کلرامفنیکل است استفاده شود باید رقت های ۴ ، ۱ ، ۰٫۴، ۰٫۲ ۰٫۰۴ng/ml ساخته شود. این رقت‌ها به صورت آماده درکیت وجود دارد.
بررسی باقیمانده پنی‌سیلین
نحوه آماده‌سازی نمونه‌ها:
۱- ۳ گرم از نمونه گوشت را برداشته و به قطعات کوچک تبدیل می‌کنیم.
۲- نمونه قطعه قطعه شده را در یک تویوپ شیشه‌ای یا پلاستیکی که قطر آن حدوداً cm 1/5 باشد بریزید که به گرما مقاوم باشد. درب آن را ببندید اما درب تویوپ را خیلی محکم نکنید.
۳- تویوپ را در میکروویو گذاشته زمان در این مرحله نقش بسیار مهمی را ایفا می‌کند که حدوداً باید بین ۲-۱ دقیقه باشد.
۴- نمونه را با بهره گرفتن از یک وسیله کوبنده آن را کاملاً می‌کوبیم تا یک شیره مناسب از آن استخراج شود.
فرم در حال بارگذاری ...
