آپوپتوز
۰۰۶/۰-r=
۰۰۰۱/۰*
۰۹۰/۰-r=
۳۳۰/۰
۱۷۸/۰r= 222/0
۴۰۲/۰r=
۰۰۰۱/۰*
۳۳۴/۰-r=
۰۰۱/۰*
۱۰۶/۰-r=
۰۰۰۱/۰*
*: معنی دار در سطح ۰۵/۰ (P value=0.05)
r: ضریب همبستگی
۳-۹- رابطه میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم با میزان آپوپتوز اسپرم
یک رابطه مستقیم (مثبت) بین میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم و میزان آپوپتوز نمونه ها دیده شد.
۳-۱۰- نتایج کلی
۱- پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up میزان قابلیت حیات اسپرم به ۱۰۰ درصد رسید.
۲- در همه نمونه های مورد مطالعه پس از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up میزان تحرک و مورفولوژی افزایش و درصد اسپرم های بی تحرک کاهش معنی داری را نشان دادند.
۳- بعد از آماده سازی اسپرم به روش Direct Swim-up درصد قطعه قطعه شدن DNA اسپرم به طور معنا داری کاهش داشت.
۴- بعد از انکوباسیون اسپرم در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد در زمان های مختلف(۳،۲،۱،۰) مشاهده شد که پس از گذشت دوساعت میزان قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم به طور معناداری افزایش نشان داد، که مشخص می کند بهترین زمان برای انکوباسیون اسپرم در دمای ۳۷درجه سانتی گراد زمان کمتر از دو ساعت برای نمونه های اسپرم نرمال می باشد.
فصل چهارم
بحث
۴-۱- تاثیر روش آماده سازی Direcct Swim up بر روی پارامترهای اسپرم
در این تحقیق همانطور که انتظار می رفت میزان تحرک اسپرم و اسپرم ها با مورفولوژی سالم و همچنین اسپرم های زنده نسبت به قبل از شستشوی اسپرم به روش Direct swim up افزایش چشمگیری داشتند و نیز میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم و آپوپتوز به طور معنی داری نسبت به قبل از آماده سازی اسپرم به روش Direct swim up کاهش نشان داد .
محققین دیگری نیز به نتایج مشابه ی در مورد بهبود پارامترهای اسپرم در روش Swim up دست یافتند، به طوری که اسپرم های جمع آوری شده، هم از نظر تعداد و هم از نظر مورفولوژ ی طبیعی از میزان بیشتری نسبت به رو ش های د یگر برخوردار بود(Michaeli, Peer, Anderman, Ballas, & Ellenbogen, 2004). بعضی از محققین با مقایسه دو روش Swim up و Percoll Gradient به این نتیجه رسیدند که اگرچه تعداد اسپرم در روش Percoll به صورت معنی داری بیشتر از روش Swim up است ولی درصد حرکت پیشرونده در روش Swim up بیشتر است . همچنین این روش بر ای افزایش قابلیت باروری در سیکل های درمانی و حذف اسپرم هایی که از بلوغ کمتری برخوردار بوده و یا در مرحله آناپلوئیدی به سر می برند؛ مناسب می باشد (Jakab, et al., 2003). علی رغم این که روش های مختلفی برای جداسازی اسپرم وجود دارد؛ اما بسیاری همچنان بر روش شستشو و Swim up مایع سیمن تاکید داشته و آن را برای دستیابی به اسپر م های با حرکت بیشتر و پیشرونده، مناسب می دانند(Paasch, Grunewald, & Glander, 2007). یکی دیگر از پارامترها ی اصلی اسپرم ، میزان مورفولوژ ی طبیعی آن است که نقش تعیین کنند ه ای در باروری افراد دارد . لذا اگر طی انجام روشی، بتوان میزان بیشتری از اسپر م های طبیعی را جمع آوری نمود ؛ مسلما میزان باروری نیز افزایش خواهد یافت. Scott به مقایسه تاثیر یک بار و دوبار شستشو در روش Swim up بر مورفولوژی سر اسپرم پرداخت و به این نتیجه دست یافت که دو بار شستشو در روش Swim up باعث می گردد تا اسپرم هایی که دارای شکل طبیعی و دار ای واکنش آکروزومال بهتر ی هستند ؛ جدا شوند و یا اسپرم هایی جدا شوند که از توانایی بیشتری در مقابل محیط هیپواسماتیک برخوردارند (Esteves, Sharma, Thomas Jr, & Agarwal, 2000).. عده ای نیز بر این باورند که در روش Swim up میزان قطعه قطعه شدن DNA نیز به صورت معنی داری کاهش می یابد(Younglai, Holt, Brown, Jurisicova, & Casper, 2001). نتیجه این تحقیق موید آن است که کاهش میزان میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم می تواند باعث افزایش لقاح و تشکیل جنین در روش های کمک باروری (ART) و همچنین افزایش میزان حاملگی و تولد نوزاد زنده شود. بعضی از مطالعات نشان می دهد که اگرچه روش Swim up شاید کمک چندانی به نمونه های طبیعی ننماید و حتی ممکن است در این خصوص روش هایی مثل Percoll Gradient بهتر از آن عمل نماید ولی این روش در نمونه های اولیگواسپرمی، آستنواسپرمی و تراتواسپرمی کاملاً تاثیر خود را نشان داده و باعث می گردد تا اسپرم های طبیعی بیشتری جدا شوند و درمان ناباروری از نتا یج بهتر ی برخوردار باشد(Adiga & Kumar, 2001). به همین دلیل، بعضی از محققین انجام Swim up double washing را پیشنهاد داده و معتقدند که این روش مخصوصاً برای انجام IVF که اسپرم ها باید در اطراف اووسیت قرار گرفته و در محیط انکوباتور، لقاح انجام پذیرد ؛ بسیار مناسب بوده و نتایج بهتری را دنبال خواهد داشت (Chen, et al., 1995). همین ایده در روش آماده سازی اسپرم بر ای انجام IUI نیز وجود داشته و بس یار موثر بوده؛ منتها روش Swim up تک مرحله ای آسان تر و کم هزینه تر بوده است(Inaudi, Petrilli, Joghtapour, Trusso, & Petraglia, 2002).
برخی دیگر بر این باورند که swim up باعث می گردد تا تعداد و حرکت اسپرم ها در افرادی که نرموآزواسپرمی و یا آستنوتترازوسپرمی هستند، افزایش یابد(Purvis & Egdetveit, 1993) و یا اینکه با حذف اسپرم هایی که از بلوغ کمتری بر خوردار ند(Scott, Oehninger, Menkveld, Veeck, & Acosta, 1989) و همچنین کاهش میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم(Younglai, et al., 2001) و جدا شدن اسپرم هایی که با سر بیضی شکل خود دارای ناحیه آکروزومی بزرگتری هستند (Dominguez, Burgos, & Fornes, 1999)، لقاح نیز افزایش یافته و به ازای هر سیکل ممکن است تا ۱۰ درصد حاملگی نیز افزایش نشان دهد. پس می توان به این نتیجه رسید که روش Direct swim up یک روش مناسب برای آماده سازی نمونه های سیمن برای استفاده در تکنیک های کمک باروری مخصوصا برای استفاده در روش IUI به این دلیل که در این روش معمولا از نمنوه های نرمال استفاده شده و روش Direct swim up بسیار مناسب برای نمونه های نرمال است .
۴-۲- تاثیر زمان های مختلف انکوباسیون اسپرم در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد بر روی قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم
انکوباسیون اسپرم آماده شده و شسته شده در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد برای استفاده در تکنیک های کمک باروری (ART) امری واجب و معمول است که در مراکز ناباروری صورت می گیرد. بررسی تاثیر انکوباسیون آزمایشگاهی اسپرم از تحقیقات و پژوهش هایی است که مورد توجه محققین در دهه ی اخیر قرار گرفته است. تحقیقات اولیه در مورد اثر انکوباسیون اسپرم بر روی پارامترهای اسپرم نظیر تحرک، قابلیت حیات و مورفولوژی بوده است. با مشخص شدن نقش مهم سلامت و کیفیت DNA اسپرم در باروری و موفقیت تکنیک های کمک باروری و همچنین معرفی تکنیک های جدید برای ارزیابی وضعیت و سلامت DNA اسپرم مثل بررسی آپوپتوز اسپرم به وسیله ی تکنیک TUNEL، بررسی ساختار کروماتین اسپرم توسط روش SCSA، مشخص کردن قطعه قطعه شدن DNA اسپرم به وسیله تست SCD و روش comet می توان اشاره کرد.بسیاری از گروه های تحقیقاتی تلاش های زیادی برای پیدا کردن ارتباط بین انکوباسیون کوتاه مدت و طولانی مدت سلول های اسپرم با یکپارچگی DNA اسپرم انجام داده اند(Calamera, et al., 2001; Matsuura, Takeuchi, & Yoshida, 2010; Muratori, et al., 2003; Zhang, et al., 2011). ما در این مطالعه آینده نگر سعی داشتیم اثر زمان های مختلف بر روی میزان قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز سلول های اسپرم نرمال آماده شده به روش Direct swim-up در اثر انکوباسیون در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد را پیدا کنیم، که بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم را با بهره گرفتن از تست SCD و بررسی میزان آپوپتوز اسپرم به وسیله تکنیک TUNEL صورت گرفت.
نتیجه ای که ما در این مطالعه به دست آوردیم نشان داد که بعد از گذشت دو ساعت انکوباسیون اسپرم در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم و آپوپتوز به میزان قابل توجهی افزایش پیدا می کند. به تازگی Matsuura وهمکاران در سال ۲۰۱۰ اثر انکوباسیون اسپرم در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد بدون CO2 و دارای CO2 را بر روی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم بررسی کردند. آنها دریافتند که پس از گذشت ۳ ساعت و ۲۴ ساعت میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم در انکوباتور CO2 دار نسبت به بدون CO2 به صورت معنی داری بالا بوده و همچنین میزان قطعه قطعه شدن DNA و آپوپتوز اسپرم در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد نسبت به دمای اتاق به صورت معنی داری بالا بوده است. آن ها از روش SCSA برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA استفاده کردند (Matsuura, et al., 2010). Dalzell و همکاران در سال ۲۰۰۴ نشان دادند که DNA اسپرم حاصل از عمل TESE بعد از گذشت ۴ ساعت انکوباسیون در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد دچار آسیب می شود. (Dalzell, McVicar, McClure, Lutton, & Lewis, 2004).
Hammadeh و همکاران در سال ۲۰۰۱ نشان دادند که انکوباسین اسپرم در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد بازشدگی و خارج شدن از حالت فشرده هسته اسپرم هنگام لقاح با تخمک را کاهش می دهد. آن ها مشاهده کردند که بعد از دو ساعت انکوباسیون میزان عدم خروج هسته ی اسپرم از حالت فشرده از ۲۵ درصد به ۸۸ درصد افزایش پیدا می کند(Hammadeh, Strehler, Zeginiadou, Rosenbaum, & Schmidt, 2001).
در یک مطالعه انجام شده توسط Fernandez وهمکاران در سال ۲۰۰۷ در مورد پویایی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم اسب نر بوده است نشان دادندکه بیشترین میزان آسیب که به DNA اسپرم وارد شده زمان های بیش از ۶ ساعت انکوباسیون اسپرم در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد می باشد. در این تحقیق از تست SCD برای بررسی میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم استفاده شده بود. همچنین اثر مضر دیگری که انکوباسیون اسپرم در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد روی اسپرم می گذارد تغییرات مورفولوژیکی سر اسپرم است که میزان باروری اسپرم را تحت تاثیر قرار می دهد و باعث کاهش میزان باروری اسپرم می شود(López-Fernández, et al., 2007). Peer و همکاران نشان دادند که میزان قطعه قطعه شدن DNA اسپرم و آپوپتوز اسپرم های دارای واکوئل بعد از دو ساعت انکوباسیون در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد نسبت به دمای ۲۱ درجه سانتی گراد به میزان معنی داری افزایش پیدا می کند(Peer, et al., 2007).
نتایج و یافته هایی که ما در این مطالعه به دست آوردیم با یافته های دیگر محققان در مورد قطعه قطعه شدن DNA اسپرم پس از آماده شدن به روش Direct swim-up مشابه است(Muratori, et al., 2003; Zhang, et al., 2011). Zhang و همکاران در سال ۲۰۱۱ نشان دادند که قطعه قطعه شدن DNA اسپرم انسانی پس از ۴ ساعت انکوباسیون در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد افزایش می یابد، در حالی که آن ها هیچ تفاوت معنی داری را پس از دو ساعت انکوباسیون اسپرم در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد مشاهده نکردند(Zhang, et al., 2011). ممکن است علل احتمالی این نتایج به خاطر روش آماده سازی اسپرم باشد. Zhang و همکاران اسپرم را به روش Indirect swim-up آماده کردند در حالی که ما به روش Direct swim-up آماده سازی و شستشوی اسپرم را انجام دادیم و همچنین محیط کشتی که برای آماده سازی و نگهداری اسپرم Zhang و همکاران استفاده کردند با مطالعه ی ما متفاوت بوده است به طوری که Zhang و همکاران از محیط Ham’s F10 همراه با G-IVF استفاده کردند در حالی که ما از Ham’s F10 به همراه آلبومن ۵ درصد استفاده کردیم. یکی دیگر از تفاوت هایی که وجود داشته است نحوه ی انکوباسیون اسپرم بوده است که Zhang و همکاران اسپرم را در انکوباسیون CO2 دار ۵ درصد در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه کردند در حالی که ما اسپرم را در انکوباسیون بدون CO2 در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه کردیم.
نتایج ما متضاد و ناسازگار با نتایج Calamera و همکاران است که در سال ۲۰۰۱ انجام دادند آنها ارزیابی اثر گذشت زمان ( بلافاصله پس از شستشوی اسپرم به روش Swim-up تا ۴۷ ساعت) بر روی پارامترهای اسپرم و یکپارچگی DNA را انجام دادند و دریافتند که تفاوت معنی داری بین زمان های مختلف انکوباسیون بر روی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم وجود ندارد(Calamera, et al., 2001). یکی از علت های احتمالی ممکن است مربوط به روش مورد استفاده برای ارزیابی قطعه قطعه شدن DNA باشد که مورد استفاده قرار گرفته است. آن ها از روش آکریدین اورنژ (AO) برای بررسی یکپارچگی DNA اسپرم مورد استفاده قرار دادند. در حالی که ما در این تحقیق از روش SCD برای بررسی قطعه قطعه شدن DNA اسپرم و از تکنیک TUNEL برای بررسی آپوپتوز اسپرم استفاده کردیم. روش های آکریدین اورنژ ، SCD و TUNEL ودیگر روش های بررسی آسیب DNA روش های متغیر وابسته به فرد هستند، یعنی ممکن است
فرم در حال بارگذاری ...