وبلاگ

توانایی موضعی

 

 

 

خیلی زیاد

 

خوب

 

خوب

 

کم

 

خوب

 

ضعیف

 

تکرار پذیری

 

 

 

(قره ویسی، 1389)
2-14 تکنیکRFLP PCR-
در این روش دی. اِن. اِ استخراج شده به وسیله آنزیم محدودکننده که عمدتاً توالی 4 تا 6 تایی را به طور اختصاصی بر روی ژنوم شناسایی کرده و سپس در جایگاه ویژه­ای، درون توالی شناسایی ژنوم را می­شکند، برش داده می­ شود. قطعات حاصل از فعالیت آنزیمی توسط الکتروفورز روی ژل (آگارز یا اکریل آمید) جدا شده و بعد از رنگ آمیزی قطعاتی که دارای طول و وزن مشابه­ای هستند به صورت یک باند ظاهر می­شوند این قطعات را “چند شکلی موجود بین طول باندها” می­نامند. در ژنوم بزرگی مانند ائوکاریوت­ها باید از تکنیک دو رگ­گیری با کاوشگرهای^[42] دی. اِن. اِ خالص مانند سی. دی. اِن. اِ^[43] یا گنجینه­های ژنومی برای شناسایی تفاوت طول قطعات حاصل از هضم دی. اِن. اِ توسط آنزیم­ های محدود­گر استفاده شود (نیکلاس، 1996).

از محاسن RFLP می­توان به:

 

 

• بالابودن تکرار پذیری و دقت و قابلیت اعتماد این نشانگر

 

 

 

• بالا بودن فراوانی آن

 

 

 

• تحت تاثیر عوامل محیطی داخلی و خارجی نبوده و صد درصد ژنتیکی است

 

 

 

• هم­بارز می­باشد

 

 

RFLP دارای معایبی هم­چون:

 

 

• هزینه اولیه بالا

 

 

 

• نیاز به مقدار نسبتا زیاد دی. اِن. اِ

 

 

 

• در گونه­ های بسیار نزدیک این نشانگرها آلل مشابه­ای را نشان می­ دهند (گله داری، 1385).

 

 

2-15 آنزیم­ های برشی
آنزیم­ های برشی آنزیم­هایی هستند که ردیف خاصی از دی. اِن. اِ را شناسایی می­ کنند و آن­ها را در یک نقطه برش می­ دهند. ردیف­های مورد شناسایی آنزیم­ های محدودگر ممکن است 4 تا 8 نوکلئوتید طول داشته باشند، بیشتر این ردیف­ها پالیندروم^[44] هستند.
این آنزیم­ها را گاهی آنزیم­ های برشی یا محدودکننده نیز می­نامند (گله­داری و همکاران، 1385). منشاء اکثر این آنزیم­ های برشی باکتری­ ها می­باشند و تا کنون حدود 200 نوع آنزیم محدود کننده جداسازی شده و توالی­های مورد شناسایی آن­ها نیز تعیین شده است. به طور کلی دو نوع برش به وسیله آنزیم­ های اندونوکلئازی محدود کننده ایجاد شده و منجر به تولید دو سری مختلف از قطعه­ی دی. اِن. اِ می­ شود.
انتهای چسبناک: این برش­ها به وسیله آنزیم­ها ایجاد می­شوند که پس از برش با این آنزیم­ها قطعاتی حاصل می­شوند که در انتها تک رشته­ای هستند و قادرند که بار دیگر به وسیله پیوندهای هیدروژنی به هم متصل شوند.
انتهای صاف: این برش­ها به وسیله­ آنزیم­هایی ایجاد می­شوند که رشته دی. اِن. اِ را به طور عمودی برش می­ دهند و در نتیجه قطعاتی با انتهای صاف به وجود می­آورند که قادر به اتصال مجدد به یکدیگر نمی­باشند (امتیازی و کریمی، 1386).
2-15-1 انواع آنزیم­ های محدودکننده
آنزیم­ های محدودکننده نوع I: این آنزیم­ها به ATPو SAM (آدنوزین مونو فسفات) به عنوان کوفاکتور واکنش نیاز دارند.
آنزیم­ های محدودکننده نوع II: آنزیم­ های این دسته به Mg به عنوان کوفاکتور نیاز دارند.
آنزیم­ های محدودکننده نوع III: این گروه از آنزیم­ها هر دو فعالیت محدود کنندگی و تعدیل­کنندگی توسط یک کمپلکس آنزیمی که شامل زیر واحد­های مختلط است انجام می­ دهند و به ATP و SAM نیاز ندارند (مهدوی و همکاران، 1386).
2-16 چند شکلی^[45]
وجود تفاوت­های قابل رؤیت که از ژن­هایی با فراوانی بینابینی ناشی می­شوند پلی­مورفیسم یا چندشکلی می­نامند، این اصطلاح همچنین در مورد مکان­های ژنی دارای چند آلل نیز به­کار می­رود (فالکونر، 1392). جایگاهی را پلی­مورف می­گویند که برای یک ژن، دو یا چند آلل در آن وجود داشته باشد و همچنین فراوانی آلل کمیاب حداقل 1 درصد و فراوانی آلل فراوان­تر حداکثر 99 درصد باشد (صبور علمی غروری، 1384). تنوع در صفات ظاهری، چند شکلی کروموزومی، چند شکلی پروتئین­ها و چندشکلی و چندشکلی دی. اِن. اِ اشکال مختلف بروز چندشکلی می­باشند. چند شکلی­هایی که در سطح دی. اِن. اِ وجود دارند، ممکن است در سطح توالی­های کد کننده و یا در توالی­های غیر کد کننده وجود داشته باشند. چند شکلی­های دی. اِن. اِ که در داخل و اطراف توالی­های ساختاری و یا تنظیم کننده یک ژن با اثرات فیزیولوژیک مشخص اتفاق می­افتد (مثلاً ژن­های هورمون­ها و پروتئین­های شیر)، ممکن است به طور مستقیم بر بیان ژن اثر گذار باشند و بدین وسیله در تغییرات فنوتیپی بین افراد از لحاظ صفات تولیدی مشارکت داشته باشند. این نوع چندشکلی­ها با صفات تولیدی به طور نزدیکی مرتبط می­باشند و می­توانند به عنوان نشانگر انتخاب به­کار برده شوند. مطالعات مختلف نشان داده است که تعدادی از جهش­های نقطه­ای در ژن­های ساختاری که دارای الگوی وراثت مندلی هستند، با صفات کمی دارای اهمیت اقتصادی مرتبط می­باشند، به عنوان مثال چند شکلی پروتئین­های شیر با تفاوت­های موجود در ترکیب و خصوصیات فرآوری شیر مرتبط می­باشد. تغییرات موجود در توالی­های غیر کد کننده (مثلاً در مناطق بین ژنی) به طور غیر مستقیم به عنوان نشانگر جهت تجزیه و تحلیل پیوستگی به کاربرده می­شوند (مکپیاک^[46]، 2001). امروزه با به کارگیری تکنیک­های مولکولی و استفاده از نشانگرهای دی. اِن. اِ امکان شناسایی ساختار اصلی سیستم­های ژنی و تنوع موجود در جوامع برای نواحی ویژه­ای در سطح ژنوم و انتخاب بر اساس نشانگرهای مولکولی فراهم آمده است (هانوتی^[47] و همکاران، 2005). جمعیت­های چند شکل انعکاس دهنده یک خزانه ژنی مطلوب می­باشند. یک جایگاه زمانی چند شکل خواهد بود که اولاً برای یک ژن دو یا چند آلل وجود داشته باشد و ثانیاً از آلل نادر و کمیاب حداقل 01/0 درصد و از آلل فراوان­تر 99/0 درصد در بین اعضای جمعیت وجود داشته باشد (ولی­زاده و مقدم، 1377).
2-17 تنوع ژنتیکی^[48]
تنوع ژنتیکی شامل تنوع درون­نژادی و بین­نژادی می­باشد (کانتانن^[49] و همکاران، 2000). اصلاحگران از تنوع ژنتیکی برای رسیدن به حیوانات اهلی منطبق بر احتیاجشان بهره­ گیری می­نمایند. فقدان تنوع، قدرت انتخاب موجود برای رفع نیازهای غیر قابل پیش بینی آتی را محدود می­سازد. تنوع درون­نژادی پیوسته با تنوع جدید ناشی از جهش مواجه است ولی تنوع ژنتیکی بین­نژادی را نمی­ توان به راحتی بازسازی نمود. هر نژاد یا سویه حاصل فرآیندهای جهش، رانش ژنتیکی، تکامل و سازگاری مجزایی است که طی قرون متمادی حاصل گردیده است (هدریک^[50]، 1999). احتمالاً متجاوز از 4500 نژاد و سویه حیوان اهلی در جهان وجود دارند که ذخایر ژنتیک حیوانی جهان را تشکیل می­ دهند که بیش از 30 درصد آن­ها در معرض خطر انقراض بوده و تعداد بسیار بیشتری نیز به واسطه بهره ­برداری نادرست تهدید می­گردند (کوشوا^[51] و همکاران، 1996). بنابراین با حفظ نمونه­هایی از تمامی نژادهای یک گونه که دارای بیشترین تفاوت ژنتیکی می­باشند، می­توان حداکثر تنوع ژنتیکی را حفظ نمود (گیووامباتیستا^[52] و همکاران، 2001). این نمونه­ها نژادهایی را شامل می­گردند که دارای آلل­ها یا ترکیبات آللی منحصر به فرد می­باشند. شرح کامل تفاوت ژنتیکی بین هر دو نژاد امکان­ پذیر نیست ولی معیارهای فاصله ژنتیکی بهترین شرح در دسترس برای بیان تفاوت ژنتیکی آن­ها می­باشند (بارکر^[53]، 1994). هتروزیگوت­ها طیف وسیعی از ژنوتیپ­ها را به وجود می­آورند. همچنین موجودات هتروزیگوس از نظر صفات اقتصادی مانند رشد، باروری و مقاومت به بیماری­ها اهمیت زیادی دارند. هتروزیگوسیتی در یک جمعیت به دو شکل هتروزیگوسیتی مورد انتظار و هتروزیگوسیتی مشاهده شده بیان می­گردد (گای^[54] و همکاران، 2005). بر اساس قانون هاردی- وینبرگ در یک جمعیت که در آن آمیزش­ها به صورت تصادفی انجام می­پذیرد، در صورت عدم وجود مهاجرت، جهش و انتخاب، فراوانی­های ژنی و ژنوتیپی از نسلی به نسل دیگر ثابت باقی می­ماند. به علاوه، بین فراوانی­های ژنی و ژنوتیپی رابطه­ ساده­ای وجود دارد. جمعیتی که فراوانی ژنی و ژنوتیپی ثابتی داشته باشد، جمعیت در حال تعادل هاردی- وینبرگ نامیده می­ شود (فالکونر، 1392). به منظور بررسی تعادل هاردی- وینبرگ در یک جمعیت می­توان از آزمون کای مربع استفاده نمود. یکی از محدودیت­های این روش این است که نمی­ توان از آن در مواردی که فراوانی مورد انتظار در فنوتیپ­ها کمتر از 5 است، استفاده نمود. از آن­جایی که فرمول کای مربع از یک توزیع پیوسته (توزیع نرمال) مشتق شده است و در بسیاری از مسائل رده­های فنوتیپی مجزا مورد بحث قرار می­گیرند، اصلاحی در محاسبات کای مربع صورت گرفته است تا این عدم پیوستگی را تصحیح نماید. اصلاح │o_i- e_i│ یک قدر مطلق (مثبت) است (استانسفیلد، 1387):
فرمول (2-1) X² = (اصلاح شده)
در رابطه بالا نشان دهنده جمع حالاتی است که در آن دسته­های I از 1 تا n افزایش می­یابند، همچنین o_i و e_i به ترتیب نشان دهنده اعداد مشاهده شده و اعداد مورد انتظار در آن دسته می­باشند. فراوانی یک ژنوتیپ معین، نسبت یا درصد افراد آن ژنوتیپ در میان کل افراد است. در یک جایگاه ژنی با دو آلل A و a، در صورت در دست بودن فراوانی­های ژنوتیپی افراد، فراوانی­های ژنی آن مکان را می­توان به صورت زیر به دست آورد:
(فرمول 2-2) F(A)= p=
(فرمول 2-3) F(a)= q =
در این رابطه p و q به ترتیب فراوانی آلل­های A و a می­باشند و N نشان دهنده تعداد افراد موجود از هر یک از ژنوتیپ­ها در جمعیت می­باشد. در این حالت بر اساس قانون هاردی- وینبرگ فراوانی ژنوتیپ­های AA، Aa و aa در نتاج به ترتیب برابر p²، 2pq و q² خواهد بود و مجموع فراوانی­ها برابر با یک می­باشد:
(فرمول 2-4) 1 = q² + 2pq + p²
با توجه به توضیحات بالا، هتروزیگوسیتی مورد انتظار را می­توان با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه نمود: