وبلاگ

+ شانکر ضعیف، +++ شانکر قوی، - بدون علایم، HR علائم فوق‏حساسیت
A : استرین آسیا
B-strain (X. axonopodis pv. Aurantifolii): آمریکای جنوبی (آرژانتین، پاراگوئه و برزیل)
C-strain (X. axonopodis pv. Aurantifolii): برزیل
A^W: مناطق ولینگتون، فلوریدا
A^*: مناطق جنوب غربی آسیا
علایم و چرخه‌ی بیماری^[۲۷]
شناسایی و اتصال به میزبان، نفوذ، تکثیر، آلودگی و انتشار از جمله مراحلی است که باکتری در برهمکنش با میزبان جهت ایجاد بیماری طی می‏کند (دوان و همکاران، ۱۹۹۹). علایم این بیماری شامل زخم‌های برآمده و نکروتیک مشخص بر روی برگ‌ها، بدشکلی میوه‌ها، ریزش پیش از موعد میوه، خشکیدگی سرشاخه‌ها و ضعف عمومی درخت می‌شود. البته این بیماری سیستمیک نمی‌باشد و باعث زخم‌های موضعی^[۲۸] می‌شود (اسکولتیس و همکاران، ۱۹۸۷).
اندازه‌ی تاول‌ها به رقم مرکبات و سن گیاه بستگی دارد و ممکن است به ۶ میلی‌متر برسد. برگ‌ها تا ۶ هفتگی حساس هستند و به‏دلیل دوره‌ی کوتاه حساسیت تاول‌های روی برگ متنوع نیستند. میوه تا ۴۰ روز پس از تشکیل حساس است و به همین دلیل تاول‌های ناشی از بیماری شانکر از نظر اندازه یکسان نیستند (سیورلو، ۱۹۸۱). در صورت وجود رطوبت آزاد در سطح تاول‌های(شانکرهای) برگ، شاخه و میوه، ترشحات حاوی باکتری از این شانکرها خارج و می‌تواند بافت‌های تازه و جدید را آلوده کند (گابریل و برونینگ، ۲۰۰۳).
میزبان حساس، شرایط محیطی مناسب شامل گرمای توأم با بارندگی و باد (بویژه طوفان‌های همراه با شن)، سابقه‌ی یخ‌زدگی در سال قبل و فعالیت آفت مینوز و همچنین وجود منبع عامل بیماری از جمله شرایط مناسب برای تکثیر و انتشار عامل بیماری و همه‌گیر شدن بیماری می‌باشد (نیوان، ۱۹۶۱).

ابزارهای ایجاد بیماری، تحت اختیار باکتری
باکتری‌های بیماری‌زای گیاهی^[۲۹] نیز مثل سایر پاتوژن‌ها جهت فائق آمدن بر سیستم‌های دفاعی فعال و غیر فعال گیاه نیازمند ابزارهایی جهت غلبه بر این سیستم و ایجاد بیماری در گیاه می‌باشد که بدین منظور ابزارهای مختلفی جهت تحقق این هدف در طول تکامل بسته به نیاز باکتری در آن ایجاد شده است.
شانکر باکتریایی مرکبات نیز که به وسیله‌ی Xcc ایجاد می‌شود، از مکانیسم‌های مختلفی جهت تکثیر در میزبان بهره می‌برد که در امتداد آن شناسایی و اتصال به میزبان به کمک ترکیبات فنلیک مترشحه از جانب گیاه و همچنین پروتئین ادهیسین^[۳۰] و اگزوپلی‌ساکارید^[۳۱] زانتان و بدنبال آن با بهره‌گیری از ژن‌های hrp^[32] و سیستم‌های ترشحی^[۳۳]، افکتورهای بیماری‌زایی خود را به داخل سلول میزبان فرستاده که موجب تعدیل سیستم میزبان به نفع خود می‌شود (گوتو، ۱۹۸۵).
جذب، اتصال و ورود باکتری به گیاه
اولین مرحله در واکنش بین گیاه و باکتری تشخیص و جذب^[۳۴] باکتری به طرف ترکیبات مترشحه از اندام‌های هوایی و زخم است (تاکاشی، ۱۹۸۴) که این مرحله توسط پدیده‌ی شیموتاکسی^[۳۵] صورت می‌گیرد. سیگنال‌هال اختصاصی در گیاه و پروتئین‌های تشخیصی در باکتری باعث ایجاد ارتباط می‌گردند. در واکنش گیاه- بیمارگر، باکتری به صورت مداوم تغییرات فیزیولوژیکی گیاه را مورد سنجش قرار می‌دهد. ادهسین، اگزوپلی‏ساکارید و لیپوپلی‏ساکارید از جمله ابزارهای تحت اختیار باکتری عامل شانکر در این راستا می‌باشند (گوتو و همکاران، ۱۹۷۹ و کینگسلی و همکاران، ۱۹۹۳). بعد از مرحله‌ی جذب، مرحله‌ی اتصال سلول‌های باکتریایی به سطح بافت گیاهی جهت ایجاد واکنش ضروری است. چندین فاکتور گیاهی در این واکنش نقش دارند، از جمله لکتین‌های گیاهی که به‏عنوان ناحیه‌ی گیرنده یا دریافت کننده‌ی ترکیبات پلی‌ساکاریدی خارج سلولی (EPS) مانند زانتان عمل می‌کنند. همچنین یک پروتئین غشا خارجی وابسته به Ca²⁺ به نام ادهسین ساخته می‌شود که در اتصال باکتری به دیواره‌ی سلولی میزبان نیز نقش دارد (اسکرکر و برگ، ۲۰۰۱). علاوه بر این باکتری‌ها برای این هدف دارای ضمایم سطحی هستند که به آنها فیمبریا و پیلوس می‌گویند که باعث چسبیدن باکتری به سطح بافت گیاهی می‌شوند (هی، ۱۹۹۸). ورود باکتری به درون بافت گیاهی به صورت غیر فعال و از محل روزنه‌ها و زخم‌ها صورت می‌گیرد (رابرت و رایان، ۲۰۱۱).
سیستم‌های ترشحی باکتری
باکتری برای اینکه بتواند فاکتورهای بیماری‌زایی را به داخل سلول وارد کند از سیستم‌های ترشحی استفاده می‌کند. سیستم‌های صدور پروتئین در تمام ارگانیسم‌های زنده شامل باکتری‌های گرم منفی و ارگانل‌های یوکاریوتی مشتق از آنها حضور دارند (رابرت و رایان، ۲۰۱۱). در مقایسه با موجودات دیگر، باکتری‌های گرم منفی سیستم‌های مستقل بسیاری را برای صدور پروتئین دارا می‌باشند که شامل ۵ سیستم در باکتری زانتوموناس می‌باشد که در یک تقسیم‌بندی می‌توان، آنها را در قالب ۲ گروه بررسی کرد، گروهی که طی یک مرحله وابسته به انرژی پروتئین را از عرض غشای داخلی و خارجی باکتری عبور داده و آنرا به فضای آپوپلاستی یا حتی درون سلول میزبان تزریق می‌کند که شامل سیستم‌های نوع I، III و IV هستند و همچنین گروهی دیگر که عمل انتقال را طی دو مرحله صورت می‌دهند که شامل سیستم‌های نوع II و V می‌باشند و وابسته به مسیرهای عمومی ترشح یعنیsec و tat می‌باشند (آشا و همکاران، ۲۰۰۳).
آزمایش‌های انجام شده نشان می‌دهد که سیستم‏های ترشحی باکتری‌ در بیماری‌زایی آن نقش مهمی را ایفا می‏کنند که از این نظر سیستم ترشحی نوع سوم از اهمیت بسزایی برخوردار می‏باشد (کانگ و همکاران، ۲۰۰۲) که در ادامه به معرفی این سیستم ترشحی و اجزا آن می‏پردازیم.
سیستم ترشحی نوع III (TTSS)^[36]
سیستم ترشحی نوع III ابزاری تحت اختیار باکتری جهت جابه‌جایی پروتئین‌های بیماری‌زا به درون سیتوسول سلول‌های میزبان می‏باشد (دانگر و همکاران، ۲۰۰۵). پروتئین‌های سیستم ترشحی تیپ III که توسط خانواده‌ی ژنی hrp در باکتری‌های گرم منفی از جمله باکتری زانتوموناس کد می‌شوند را به چهار گروه ساختاری، افکتور، چاپرون و تنظیمی می‏توان تقسیم کرد (زیمارو و همکاران، ۲۰۱۱).
مکانیسم صادر کننده‌ی TTSS معمولاً متشکل از ۲۰ پروتئین مختلف و شامل پروتئین‌های محلول سیتوپلاسمی، پروتئین‌های غشای خارجی و پروتئین‌های غشای داخلی است (هووک، ۱۹۹۸ و بوخنر و بوناس، ۲۰۰۲).TTSS باکتری‌ها را قادر می‌سازند که یک تنوعی از افکتورها را مستقیماً به سیتوسول میزبان بفرستند و باعث دستکاری پروسه‌های سلولی میزبان شوند و به‏نفع باکتری آنها را از درون تخریب کنند (کلمنت، ۱۹۸۳). ژن‌های کد کننده‌ی سیستم ترشحی تیپ III روی عناصر ژنتیکی غیر پایدار، پلاسمیدها و جزایر پاتوژنیستی واقع شده‌اند که شامل خانواده‌ی ژنی hrp در Xanthomonas citri و سایر باکتری‌های گرم‏ منفی و بیماری‌زای گیاهی می‌باشند (آلفانو و کولمر، ۱۹۹۷ و بوخنر و بوناس، ۲۰۰۲).
در xcc مانند سایر پاتوژن‌های گیاهی ژن‌های کد کننده‌ی TTSS درون یک گروه بیماریزایی^[۳۷]دسته‌بندی می‌شوند (هکر و کپر، ۲۰۰۰). تشریح ژنتیکی TTSS برای اولین بار در P.syringae با کشف موتانت hrp پاتوژن لوبیا pss آغاز شد که توانایی ایجاد پاسخ فوق‏حساسیت^[۳۸] در گیاهان غیر میزبان مانند توتون و بیماری‌زایی را در لوبیا از دست داد (دانگر، ۲۰۰۵).
ژن‌های hrp و نقش دوگانه‌ی آنها
ژن‌های hrp که تا کنون فقط در باکتری‌های گرم منفی دیده شده است، ژن‌هایی هستند که وجود آنها در این باکتری‌ها برای قابلیت ایجاد نشانه‌های مشهود بیماری برگیاه میزبان و همچنین القای فوق‏حساسیت بر روی برخی از گیاهان که به طور طبیعی به آن باکتری آلوده نمی‌شوند ضروری است. توانایی باکتری در تکثیر و رسیدن به جمعیت‌های بالا در گیاه حساس، تراوش سلولی و تولید پروتئین‌های هارپین از دیگر اعمالی است که در باکتری به کمک این گروه ژنی انجام می‏شود (لیندگرن، ۱۹۹۷ و هیث، ۲۰۰۰).
بیان ژن‌های hrp تحت تأثیر شرایط محیطی و در ارتباط با میزبان می‌باشد که باکتری با بهره گرفتن از مکانیسم Q.S^[39] از شرایط محیطی اطراف خود آگاه و باعث القا یا مهار بیان ژن‌های مذکور می‌شود (باسلر، ۱۹۹۹ و اسلتر و همکاران، ۲۰۰۰). ژن‌های مربوط به کلاستر hrp در باکتری عامل شانکر توسط پروتئین‌های HrpX و HrpG کنترل می‌شوند (بگدانف و همکاران، ۱۹۹۶).
اغلب گونه‌های باکتریایی دارای دو مجموعه‌ی متمایز ژن hrp هستند که در قالب دو گروه تنظیمی و کاربردی مطرح می‌شوند. بیان ژن‌های hrp در حضور بعضی مواد غذایی، به وسیله‌ی ژن‌های تنظیمی دیگر باکتری‌ها و توسط مولکول‌‌های علامت دهنده‌ی گیاهی کنترل می‌شوند (استال، ۱۹۸۹). این گروه ژنی دومنظوره تحت عنوان کلاستر ژنی hrp برای اولین بار در Pseudomonas syringae شناسایی و مورد مطالعه قرار گرفت (لیندگرن و همکاران، ۱۹۸۶). اولین گزارش مربوط به ژن‌های hrp در جنس Xanthomonas توسط Stall (1989) و در زیرگونه‌ی campestris مورد چاپ و نشر قرار گرفت (آرلات و همکاران، ۱۹۹۱).
همچنین این کلاستر ژنی در Xanthomonas campestris pv. visicatoria (بوخنر و بوناس، ۲۰۰۲) در X. oryzae pv. oryzae (زو و همکاران، ۲۰۰۰) و همچنین درX. a Pv. Glycines (کیم و همکاران، ۲۰۰۳) مورد مطالعه قرار گرفته است. مجموعه ‌ژن‌های کلاستر ژنی hrp دارای همولوژی بالایی نسبت به هم در گونه‌های مختلف زانتوموناس می‌باشند (کاناموری و همکاران، ۱۹۹۹). با انجام مطالعاتی مثل غیر فعال سازی ژن‌های مختلف hrp با جهش‌های هدفمند می‌توان به نقش آنها چه در بیماری‌زایی و چه در القایHR^[40] پی‌برد، در مطالعه‌ای با جهش بر روی hrpB، hrpD و hrpF که در سال ۲۰۰۵ توسط Dunger صورت گرفت به روشنی به این مهم اشاره می‌کند.
پروتئین HrpN به‏عنوان اولین السیتیور^[۴۱] القا کننده‌ی واکنش فوق حساسیت در دهه ۱۹۹۰ معرفی شده است (مالونی و همکاران، ۲۰۰۵). همچنین ژن pthA به‏عنوان اولین السیتیور محرک بیماری در زانتوموناس می‌باشد که مورد مطالعه در این گونه قرار گرفته است (سواروپ، ۱۹۹۹). در کلاستر hrp، ۹ ژن به صورت حفاظت شده در جنس‌های مختلف باکتری‌های گرم منفی و بیماری‌زای گونه‌های جانوری و گیاهی عمدتاً در شکل‌گیری ترانسلوکون در سیستم ترشحی نوع III فعال هستند که hrc نامیده می‌شوند (بوخنر و بوناس، ۲۰۰۲). این گروه ژنی عموماً در ناحیه‌ی کروموزومی و با اندازه‌ای حد فاصل بین kb 30-20 قرار دارند (لی، ۲۰۱۲).
نواحی مربوط به ژن‌های hrc-hrp در باکتری‌های پاتوژن ناحیه‏ی بیماری‌زایی^[۴۲] نامیده می‌شوند (تاکور و سوهال، ۲۰۱۳). ژن‌های hrp حداقل دو عملکرد تنظیم بیان سایر ژن‌ها و سنتز پروتئین‏های هارپین^[۴۳]، را عهده‏دار هستند و به طور کلی این ژن‌ها با همکاری سایر ژن‌ها مانند ژن‌های ^[۴۴]avr به‏صورت یک پازل در ایجاد واکنش فوق حساسیت و مقاومت به بیماری عمل می‌کنند (بوخنر و بوناس، ۲۰۰۲).
hpaG اولین هارپین جداسازی شده از گونه‌ی زانتوموناس می‌باشد که با موفقیت و با بهره‌گیری از علم مهندسی ژنتیک و DNA نوترکیب علیه ویروس موزاییک توتون و القای پاسخ فوق حساسیت با موفقیت بررسی شده است (لی و همکاران، ۲۰۰۵). قابلیت القای پاسخ HR در برابر ویروس موزاییک توتون در مورد هارپین‌های hrpG و hrpX نیز به اثبات رسیده است (آلفانو و کولمر، ۱۹۹۷).
هارپین حاصله از بیان ژن hrpN در پژوهشی توسط دکتر حبشی و همکاران وی (۱۳۸۷) در مرکز بیوتکنولوژی کشاورزی کرج برعلیه بیماری آتشک در دو گیاه سیب و گلابی تست شده که تأیید کننده‌ی اثر هارپین‌ها در القای پاسخ دفاعی فوق حساسیت برعلیه بیماری مزبور در دو گیاه مورد مطالعه می‏باشد.
هارپین‌ها و نقش آنها در القای پاسخ^[۴۵]HR
فوق حساسیت نوعی پاسخ دفاعی یا به‏عبارتی فرایند سریع مرگ سلولی در موضع عمل بیمارگر در گیاه می‌باشد که توسط استکمن (۱۹۱۵) در بیماری‏های قارچی و ۵۰ سال بعد در بیماری‌های باکتریایی توسط گودمن (۱۹۶۵) کشف و مورد مطالعه قرار گرفت (محمدی، ۱۳۸۱). ویروس موزاییک توتون، پژمردگی فوزاریومی در پنبه و همچنین آتشک گلابی از جمله‌ بیماری‌های گیاهی می‌باشند که با بهره گرفتن از هارپین‌ها توانسته‌اند میزبان‌های آنها را برعلیه فیتوپاتوژن مربوطه متحمل نمایند (دونا و همکاران، ۱۹۹۹).
هارپین‌ها ممکن است با هم تشکیل دایمر دهند که این موضوع می‌تواند به برهمکنش بهتر پاتوژن با غشای گیاه کمک نماید و یا به عبارتی باعث تقویت هارپین در راستای عمل مربوطه در گیاه ‌باشد (هیث، ۲۰۰۰). این پروتئین‌های غنی از گلایسین، کوچک و مقاوم در برابر حرارت و شرایط اسیدی توسط باکتری و در پاسخ به شرایط محدود محیطی تولید می‌شوند، بنابراین تولید و خالص‌سازی آنها در محیط کشت و به کمک کشت بافت کار مشکلی می‌باشد (لیندگرن، ۱۹۹۷)، صفات مربوط به هارپین‌ها در گونه‌ی زانتوموناس با توجه به اینکه شناسایی و توالی‌یابی شده‌اند همچنان تا حد زیادی ناشناخته‏اند (دونگر و همکاران، ۲۰۰۵)، از طرفی بازدارنده‌های متابولیسم گیاهی می‌توانند مانع از عمل هارپین‌ها شوند، به‏عبارت دیگر می‌توان این‌چنین برداشت کرد که در هنگام آلوده شدن گیاه به بیماری و در پاسخ به حضور هارپین در داخل گیاه تولید مهارکننده‌های متابولیسم گیاهی به منظور ممانعت از عمل هارپین‌ها در گیاه و همچنین به‏عنوان سیگنالی در جهت فعال‌سازی مسیرهای دفاع عمومی گیاه برای القای پاسخ فوق حساسیت و در نتیجه بالا بردن آستانه‌ی تحمل گیاه در برابر بیمارگر القا^[۴۶] می‌شوند (زیمارو و همکاران، ۲۰۱۱).
بهره‌گیری از مهندسی ژنتیک در مقاومت به بیماری‌ها
مقاومت در برابر بیمارگرها، آفات و همچنین عوامل غیر زنده‌ی محیطی که در تقابل با اهداف انسانی و در تعامل با گیاه می‌باشند همواره در راستای کاهش اثرات سوء آنها بر عملکرد و کیفیت محصولات گیاهی مورد توجه بوده است. راه‌های مبارزه‌ای بسیاری اعم از راهکارهای به‌زراعی، مبارزه‌ی شیمیایی و یا مکانیکی و همچنین روش‌های بیولوژیکی و روش‌های نوین وابسته به تکنیک‌های مهندسی ژنتیک وجود دارد که بسته به شرایط می‌توانند مورد استفاده قرار گیرند.
در میان راهکارهای متنوع برای بهبود مقاومت گیاهان به بیماری‌های باکتریایی به واسطه‌ی مهندسی ژنتیک، تولید پپتیدهای ضد باکتریایی^[۴۷] با منشأ غیر گیاهی، مهار بیماری‌زایی باکتری یا فاکتورهای بیماری‌زایی، تقویت واکنش‌های دفاعی طبیعی گیاه و القای مرگ برنامه‌ریزی‌شده به طور مصنوعی در جایگاه آلودگی را می‌توان نام برد. مهندسی ژنتیک تظاهر ژن‌های بیگانه با منشأ غیر گیاهی مانند پپتیدهای غیر باکتریایی یا از گونه‌های غیر خویشاوند دور را امکان‌پذیر می‌کند (مورگس، ۱۹۹۸). در حال حاضر برای تولید گیاهان تراریخته‌ی مقاوم به بیماری‌های باکتریایی، اکثر استراتژی‌هایی که به طور رایج بررسی شده‌اند، برمبنای تلفیق ترانس‌ژن‌ها^[۴۸] با فعالیت ضد باکتریایی مستقیم یا در برابر فاکتورهای پاتوژنیستی از طریق تخریب اگزوپلی‌ساکارید رقابت برای تغذیه و دریافت آهن یا فعال‌سازی سریع و مؤثر واکنش‌های دفاعی گیاه می‌باشد (میناکشی و همکاران، ۲۰۱۳). در بسیاری از موارد، محدودیت استفاده از مواد شیمیایی جهت کنترل بیماری‌های مختلف افزایش یافته است، که علت آن اثرات زیان‌آور آنها بر محیط زیست، تغذیه‌ی انسان و دام که ناشی از مصرف آنها در مزارع و باغات، است (میناکشی، ۲۰۱۳).
از این رو وجود منابع مقاومت به بیماری‌های باکتریایی و پیشرفت‌های اخیر در تکنیک‌های تراریخت گیاهان و آشنایی با پروسه‌ی واکنش متقابل پاتوژن-گیاه زمینه را برای کاربرد مهندسی ژنتیک در به‏کارگیری ژن‌های مقاومت موجود در منابع مختلف جهت ایجاد گیاهان مقاوم به بیماری‌های باکتریایی (مورگز و همکاران، ۱۹۹۸)، از قبیل ایجاد مقاومت به بیماری شانکر در گیاه لیمو^[۴۹] و سایر گیاهان حساس به این بیماری فراهم کرده است. به طور کلی منابع مقاومتی را که تا بدین روز و در راستای ایجاد گیاهان تراریخت مقاوم در برابر فیتوپاتوژن ها مورد استفاده قرار گرفته‏اند را می‏توان در قالب ۵ گروه زیر معرفی کرد:

1. 1. ژنهایی که محصولاتشان به طور مستقیم علیه عوامل بیماریزا سمی هستند یا باعث کاهش رشد آنها می‏شوند، که شامل، آنزیم‏ها( کیتیناز^[۵۰]- گلوکاناز^[۵۱])، پروتئین‏های ضد باکتریایی، پپتیدهای ضد میکروبی(تیونین- دیفنسین- لکتین) و پروتئین‏های غیر فعال کننده ریبوزوم می‏باشند.

1. 1. ژنهایی که محصولاتشان تخریب کننده یا خنثی کننده فاکتورهای بیماریزایی مانند پلی‏گالاکتروناز، اکسالیک اسید و لیپاز باشد.

1. 1. ژن‏هایی که محصولاتشان به نوعی می‏تواند افزایش دهنده ساختار دفاعی گیاه مانند پراکسیداز و لیگنین می‏باشد.

1. 1. ژن‏هایی که محصولاتشان منجر به تولید سیگنال‏های تنظیم کننده دفاع گیاه باشد، که شامل الیسیتورهای ویژه، آب‏اکسیژنه، سالیسیلیک اسید و اتیلن می‏باشد.

1. 1. ژن‏های مقاومت که محصولاتشان در تقابل با فاکتورهای غیر بیماریزا منجر به پاسخ فوق‏حساسیت می‏شوند.

فصل دوم
مواد و روش ها
محل انجام پژوهش
این پژوهش در آزمایشگاه پژوهشکده بیوتکنولوژی گیاهی واقع در مرکز ملی مهندسی ژنتیک و زیست‏فناوری^[۵۲] و در قالب طرح ماموریت محور شانکر مرکبات در سال ۱۳۹۳ انجام شد.
مواد شیمیایی، آنزیم‏ها و کیت‏ها
تمام مواد شیمیایی مورد نیاز با خلوص بالا و مخصوص بیولوژی مولکولی از شرکت های Roche، Sigma، Fermentas، Bioneer، سیناژن وMBST تهیه گردید.
آنزیم های برشی XbaI ،SacI و BamHI ، آنزیم pfu دی.ان.آ پلیمراز، آنزیم T₄ دی.ان.آ لیگاز و بافر آن، پروتئیناز K و آنزیم آر.ان.آز A از شرکت Fermentas وآنزیم Taq دی.ان.آ پلیمراز از شرکت سیناژن، کیت خالص سازی High pure PCR product purification Kit از شرکت Bioneer و کیت استخراج پلاسمید High pure Plasmid Extraction از شرکت Roche تهیه شد. همچنین برای بررسی اندازه دی.ان.آ‏ از نشانگر ۱kb تهیه شده از شرکت Fermentes استفاده شد.
سویه‏های باکتری
در این پژوهش به منظور همسانه‏سازی و نگهداری پلاسمیدهای اصلی و نوترکیب و همچنین جداسازی ژن‏های هدف از سه سویه باکتری مختلف با اهداف متنوع بهره برده شد، که بدین منظور برای جداسازی ژن‏های hrpG و hrpW از باکتری زانتوموناس پاتووار citri، سویه‏ی NIGEB-088(A*) ، جهت انتقال ژن‏های مذکور به مرکبات از سویه­های LBA4404 و همچنین از سویه GV3101، آگروباکتریوم تومفاسینس به منظور انتقال پلاسمید‏های نوترکیب pBI-355-hrpW و pBI-355-hrpG استفاده شد. در این تحقیق همچنین از باکتری E.coli سویه DH5α برای تهیه­ سلول‏های مستعد^[۵۳] و نگهداری پلاسمیدها استفاده گردید.
پلاسمیدهای مورد استفاده
در این پژوهش از پلاسمیدهای pGEM7zf(-) و pUC19 حاوی نشانگر انتخابی مقاومت به آمپی‏سیلین و ژن LacZ’، دارای جایگاه برشی چندگانه برای همسانه‏سازی ژن‏های مورد نظر استفاده شد. به‏منظور ساخت سازه مناسب برای تراریختی گیاه از ناقل pBI121 استفاده شد. این پلاسمید حاوی ژن gus با پیشبر ویروس موزائیک گل کلم CaMV35S و خاتمه دهنده Nos به عنوان ژن گزارشگر^[۵۴] و نیز ژن nptII با پیشبر و خاتمه دهنده Nos به عنوان نشانگر انتخابی^[۵۵] مقاومت به کانامایسین به‏عنوان ناقل^[۵۶] بیانی ژن در سلول گیاه استفاده گردید. این پلاسمید همچنین دارای مناطق مرزی چپ^[۵۷] و راست^[۵۸] موجود در پلاسمید Ti است که در انتقال T.DNA از آگروباکتریوم به سلول‏های گیاهی نقش دارند. لازم به ذکر است که جهت تکثیر این پلاسمیدها از باکتری E.coli سویه DH5α استفاده شد.