وبلاگ

Extension

 

 

 

دمای اتصال(Ta) برای آغازگرها در جدول ۳-۶ و ۳-۸ ذکر شده است.

۳-۹- آنالیز داده ­های آزمون Real-time PCR
در این مطالعه روش کمی­سنجی نسبی (relative quantificatin) برای کمی کردن داده ­های حاصل از آزمون real-time PCR استفاده شد در این روش تغییرات نسخه­های ژن مشخص می­ شود و بیان ژن هدف نسبت به بیان یک ژن کنترل داخلی محاسبه می­ شود (Bowyer, 2007). بعبارت دیگر تعیین مقدار نسبی (Relative quantification ,R) بر پایه ژن کنترل داخلی می­باشد و مقدار تفاوت در الگوی بیان ژن مورد هدف را تعیین می­ کند. بدین منظور داده ­های حاصل از آزمون Real-time PCR به کمک نرم­افزار Line Gene K بدست آمدند و با رابطه­ Livak یا ۲-∆Ct (Pffafl, 2004)، طبق طرح آماری فاکتوریل قسمت ۳-۱۸، آنالیز گردیدند:

 

 

R = 2^{- ΔCt}

 

ΔCt = (Ct target- Ct ref)

 

 

 

(cycle threshhold) Ct

 

Ct ژن کنترل داخلی Ct ref:
Ctژن هدف Ct target:

 

 

 

ابتدا Ct هر نمونه برای ژن اصلی و کنترل داخلی با تعیین خط پایه (Base Line) با بهره گرفتن از نرم­افزار Line Gene K در حالت‌های دستی (manual) و اتوماتیک محاسبه شد. بدین صورت که محل تقاطع Base Line با ابتدای فاز نمایی شکل تکثیر واکنش real-time PCR به عنوان Ct در نظر گرفته شد. سپس ΔCt (دلتا سی تی) محاسبه شد، یعنی Ct هر نمونه کنترل داخلی از Ct نمونه اصلی یا ژن هدف خودش تفریق شد. (Pffafl, 2004). به منظور بدست آوردن میزان ویروس موجود در دو رقم Dorothea , 7233 نسبت به رقم Brigita (حساسترین رقم در بین ارقام بعنوان رقم شاهد) از روشی بنام Fold Change استفاده شد به این ترتیب که غلظت ویروس بدست آمده برای هر یک از دو رقم اشاره شده را به غلظت رقم Brigita تقسیم شد تا بصورت درصدی بیان شود (Emanuela Noris and Laura Miozzi, 2015)
۳-۱۰- کنترل مثبت و منفی در آزمون Real-Time PCR
محصول PCR حاصل از دی ان ای پلاسمید استخراج شده از آگروباکتریوم‌های حاوی همسانه عفونت­زای BSCTV-IR و BCTIV با آغازگرهای اختصاصی جدول ۳-۱۰-۴ و ۳-۱۰-۵ با رقت­های تا به عنوان الگوهای مثبت استاندارد در آزمون Real-Time PCR مورد استفاده قرار گرفت. همچنین برای هر بار آزمون Real-Time PCR نمونه­های شاهد (کنترل منفی) برای هر ژن هدف و کنترل داخلی به صورت زیر استفاده شد:

 

 

ژن هدف BCTIRV:

 

نمونه گیاه سالم- پلاسمید خالص BSCTV-IR- آب DEPC

 

 

 

ژن هدف BSCTV-IR:

 

نمونه گیاه سالم- پلاسمید خالص BCTIRV– آب DEPC

 

 

 

ژن کنترل داخلی:

 

نمونه گیاه سالم– آب DEPC

 

 

 

۳-۱۱- روش تهیه نمونه­های دی­ان­ای مورد استفاده در آزمون Real-Time PCR
میزان دی­ان­ای کلیه­ نمونه­ها بوسیله دستگاه نانودراپ و نرم­افزار ND-1000 در نور ماوراء بنفش (UV) طول موج ۲۶۰ و ۲۸۰ و ۳۲۰ نانومتر بر حسب نانوگرم در میکرولیتر اندازه ­گیری شد و به کمک رابطه­ زیر در غلظت ۱۰ نانوگرم بر میکرولیتر همسان­سازی شدند.
C₁ V₁ = C₂ V₂
غلظت دی­ان­ای در محلول اولیه:C₁
غلظت دی­ان­ای مورد نظر درمحلول مصرفی:C₂
حجمی از محلول اولیه که باید برداشته شود.:V₁
حجم کل محلولی که باید تهیه شود.:V₂
۳-۱۲- تهیه­ الگوهای مثبت استاندارد
در یک میکروتیوب استریل، میزان ۴۰ میکرولیتر آب مقطر تزریقی تیمار با DEPC دو بار اتوکلاو، ریخته و سپس ۱۰ میکرولیتر از محصول PCR نمونه­ مورد نظر به آن افزوده و بهم زده شد تا بطور یکنواخت در محلول منتشر شود.
از این سوسپانسیون که S0 نامیده شد، برای تهیه غلظت­های ^۱-۱۰ تا ^۱۰-۱۰ که به ترتیب S1 تا ۱۰S نامیده شدند، استفاده شد. به این منظور مطابق شکل ۳-۱، ۱۰ میکرولیتر از میکروتیوب قبلی به ۹۰ میکرولیتر آب تزریقی تیمارشده با DEPC و دو بار اتوکلاو شده اضافه گردید تا
غلظت­های مورد نظر به دست آمد.
S₀ S₁ S₂ S₃ S₄ S₅ S₆ S₇ S₈ S₉ S₁₀
شکل ۳-۱ سری رقت‌های تهیه شده از محصول PCR دی ان ای پلاسمید استخراج شده از آگروباکتریوم
۳-۱۳- روش تهیه­ آب تیمار شده با DEPC