جهت ارزیابی مورفولوژی اسپرم، از روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین استفاده شد که پس از تهیه اسمیر از نمونه اسپرم و پس از خشک شدن اسمیرها و فیکس کردن بوسیله الکل ۶۰ درجه رنگ آمیزی توسط محلول رنگی هماتوکسیلین صورت گرفت وبا استفاده از میکروسکوپ نوری و با بزرگنمایی ۴۰× مورفولوژی اسپرم ها مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفت و در این مطالعه از نمونه های اسپرم با مورفولوژی بالای ۹۵ درصد طبیعی استفاده شد.
۲-۵-۵- تخمکگیری و لقاح داخل آزمایشگاهی
بین ۱۲-۱۰ ساعت پس از تزریق hCG (صبح روز بعد) بعد از آسان کشی حیوان به روش جابجایی گردن، لولههای رحمی را جدا کرده و در داخل محیط کشت ۳۷ درجه از قبل به تعادل رسیده، قرار داده و با بهره گرفتن از تکنیک Dissecting تخمکها را خارج نموده و پس از شستشو تخمکها را به قطرات محیط لقاح در زیر روغن معدنی حاوی محیط کشت HTF حاوی ۴ mg/ml BSA منتقل کرده و سپس اسپرمهای متحرک به توانایی رسیده به تعداد یک میلیون به ازای هر میلیلیتر محیط کشت، اضافه شدند. عمل لقاح حدود ۸-۶ ساعت بعد از اضافه کردن اسپرم با مشاهده دو پیش هسته مشخص میشد و بدین ترتیب زیگوتها بدست می آمدند و تخمکهای بارور شده (زیگوت) بعد از دنود (لخت کردن) و شستشو در محیط کشت تازه از قبل به تعادل رسیده منتقل می شود.
تصویر۲-۵- نحوه و محل برش لوله های رحمی برای تخمک گیری (Nagy, 2003)
۲-۶- گروه های آزمایشی
در ادامه تحقیق زیگوت های شستشو داده شده حاصل از لقاح آزمایشگاهی به طور تصادفی در گروه های مختلف آزمایشی تقسیم گردید که به تعداد ۲۰ جنین در داخل قطرات ۱۰۰ میکرولیتری در زیر روغن معدنی[۹۰] کشت داده شدند. سپس زیگوت ها پس از شستشو در قطرات ۱۰۰ میکرولیتری حاوی محیط کشت، گروه مربوطه به قطرات ۱۰۰ میکرولیتری کشت گروه های مختلف منتقل شدند ودر مراحل بعدی ارزیابی جنین ها صورت گرفت.
۲-۶-۱- ارزیابی پیش هسته
حدود ۱۲ الی ۱۴ ساعت بعد از لقاح، جنین ها برای مدت زمان کوتاهی کشت داده شده و از نظر تشکیل پیش هسته مورد ارزیابی قرار داده شدند و آنهایی که پیش هسته و دومین گویچه قطبی در آنها موجود نبود و نیز جنین های فراگمانته و یا لیز از داخل محیط با پیپت دهانی حذف شدند.
در این مطالعه جنینها در مراحل مختلف جنینی (یک سلولی، دوسلولی، چهار سلولی، هشت سلولی و مورولا) با بهره گرفتن از روش انجماد شیشه ای[۹۱] با بهره گرفتن از محلولهای انجمادی اتیلن گلایکول و DMSO به شرح زیرانجماد داده شده و در داخل ازت مایع نگهداری شدند.
۲-۷- تهیه محیط تعادل و محیط انجماد
جهت ساخت محیط انجماد جنین ها از دو محلول تعادل[۹۲] و محلول انجماد شیشه ای[۹۳] استفاده شد. محیط پایه[۹۴] هر دو شاملF10+ %20HSA[95] Ham,s و مواد محافظ انجمادی مورد استفاده EG[96] و DMSO[97] و سوکروز[۹۸] می باشد. مواد تشکیل دهنده این دو محلول و مقادیر آنها در جداول۲-۲ و۲-۳ ذکر شده است(Succu et al., 2007) .
جدول ۲-۲ – مواد مورد نیاز برای ساخت محلول تعادل (ES) جهت انجماد جنین ها
| نوع ماده | میزان مورد نیاز |
| DMSO | ۱ ml |
| EG | ۱ml |
| F10+ %20HSA Ham,s | ml8 |
جدول۲-۳- مواد مورد نیاز برای ساخت محلول انجماد شیشه ای (VS) جهت انجماد جنین ها
| نوع ماده | میزان مورد نیاز |
| DMSO | ml 2 |
| EG | ml 2 |
| F10+ %20HSA Ham,s | ml 6 |
فرم در حال بارگذاری ...
