وبلاگ

منطقه I دارای چهار ژن به نام های bexA,B,C,D می باشد که برای تولید سیستم ترشح کپسول وابسته به ATP کد می شوند و در انتقال پلی ساکارید به سطح سلول باکتری نقش دارد (۴۱) (شکل۱-۸).

۱-۹-۱-۳: منطقه II
منطقه II دارای چهار ژن بوده و در هر سروتایپ منحصر به فرد است^[۲۱] و آنزیم های کد شده توسط این منطقه باعث تولید دی ساکارید اختصاصی هر سروتایپ می شود(۲۸،۷۰).
این ژنها در Hib به نام های bcs1,2.3.4 شناخته میشوند. حرف اول (b) نشان دهنده نوع سروتایپ می باشد و سروتایپ های دیگر نیز به همین ترتیب نام گذاری می شود(شکل ۱-۸).
۱-۹-۱-۲: منطقه III
منطقه III شامل دو ژن به نام های hcsA و hcsB می باشد که به نظر می رسد در مراحل پلیمریزاسیون کپسول و حتی در اصلاحات و ترشح پلی ساکارید نقش داشته باشند (۲۹)(شکل ۱-۸).
مطالعه سوکوپولوی^[۲۲] و همکاران در سال ۲۰۰۶ نشان داد این دو ژن به صورت مکمل در تسهیل انتقال کپسول پلی ساکاریدی به سطح سلول و ویرولانس باکتری نقش دارند. غیر فعال کردن این ژن ها به صورت جدا از هم و همزمان در این مطالعه باعث تجمع پلی ساکارید در فضای پری پلاسمی سلول باکتری شد(۶۷).
۱-۹-۱-۴: قطعه IS1016 ^[۲۳]
همه سروتایپ ها حداقل یک کپی کامل از جایگاه cap دارند که به یک قطعه به نام IS1016 متصل است. در سوش های دارای بیش از یک کپی ، دو قسمت توسط یک قطعه IS1016 از هم جدا شده اند. یعنی به ابتدای هر جایگاه cap کامل یک قطعه IS1016 متصل است(۵۷) (شکل ۱-۱۱).
قطعه IS1016 باعث سهولت در مضاعف شدن جایگاه cap در طول همانند سازی کروموزوم های خواهری، تحت تحت اثر نوترکیبی نامساوی می شود.
این قطعه در اغلب سویه ها به جایگاه cap متصل بوده و گفته می شود در یک سویه اجدادی از طریق جابه جایی^[۲۴] به وجود آمده است.
این عناصر باعث جابه جایی جایگاه cap به عنوان یک ترانسپوزون در درون کروموزوم می شود و می تواند باعث تکثیر جایگاه cap در طول نوترکیبی همولوگ شده و منجر به افزایش تولید کپسول شود.
حذف شدگی در یکی از قطعات IS1016 به همراه بخشی از ژن bexA در Hib باعث ایجاد پایداری در ساختار دوتایی جایگاه cap می شود(۳۴). این حذف شدگی باعث جلوگیری از حذف کپی دیگر bexA در طول نوترکیبی می شود. سویه های دارای حذف شدگی در تمام دنیا گسترش پیدا کرده و در حال حاضر عامل اغلب عفونت های ایجاد شده توسط Hib هستند. به همین دلیل به نظر می رسد حذف شدن این قطعه ۱٫۲kb در سویه اجدادی یک نوع برتری زیستی به باکتری اعطا کرده است(۴۰).
شکل ۱-۸: جایگاه cap و ژن های تشکیل دهنده
۱-۹-۱-۵: تعداد کپی جایگاه cap^[25]
ساختارهای ژنتیکی تولید کننده کپسول Hib بارها مورد بررسی قرار گرفته است. این جایگاه به نام cap locus یا جایگاه cap شناخته می شود. در بیشتر موارد Hib دارای یک توالی دوتایی ناقص از جایگاه cap است اما در مواردی حتی تا ۶ کپی از این جایگاه نیز گزارش شده است(۱۹) . این دو جایگاه کاملا در مناطق II و III مشابه هم هستند، یکی از کپی ها دارای منطقه I کامل و دیگری معمولا دارای یک حذف شدگی به اندازه ۱٫۲kb در منطقه I می باشد.، که این حذف شامل بخشی از ژن bexA و IS1016 می شود. به عبارتی یک کپی کامل به اندازه ۱۸kb و یک کپی ناقص با حذف شدگی وجود خواهد داشت(۶۳).
این آرایش دوتایی ناقص به باکتری اجازه تکثیر بیشتر ژن کپسول و در نتیجه افزایش تولید پلی ساکارید کپسولی را می دهد که باعث افزایش شدت بیماری زایی Hib می شود(۵۷) .
تصور می شود وجود IS1016-bexA ناکامل در انتهای یکی از جایگاه ها به دلیل ایجاد ثبات در تولید کپسول با کاهش احتمال نوترکیبی می باشد.
با این حال منطقه ژنتیکی تولید کننده کپسول در این باکتری تا حدودی ناپایدار است و ۵/۰ – ۱% از سوش های Hibبه صورت خود به خودی بیان کپسول خود را از دست می دهد. ولی در سروتایپ های غیر از b از دست دادن کپسول تا کنون گزارش نشده است (۳۴،۵۷).
اگر در طول نوترکیبی یک کپی کامل از جایگاه cap از بین برود کپی ناقص باقی خواهد ماند که شامل یک ژن bexA ناقص است (یک جزء متصل به ATP که برای انتقال اجزاء کپسول به سطح باکتری ضروری است). این نوع باکتری دارای یک کپی ناقص از جایگاه cap را Hib‾ با b‾ می نامند.(۶۳) (شکل ۱- ۸-c)
۱-۹-۱-۶: تکامل ژنوم سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا
بر اساس آنالیزهای ژنتیکی، جمعیت کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا به دو گروه فیلوژنتیکی^[۲۶] تقسیم می شود.
گروه I بیشتر سویه های تیپ a و b و تمام سویه های d , c و e را شامل می شود. گروه II نیز شامل تمام سویه های تیپ f و برخی سویه های تیپ a و b است(شکل ۱-۹).
در دسته I، جایگاه cap بین دو قطعه IS1016 قرار گرفته است و ظاهرا جایگاه cap به عنوان یک ترانسپوزون^[۲۷] و با کمک قطعات IS1016 در کروموزوم جابه جا می شود.
وجود یک حذف شدگی به طول ۱٫۲kb در یکی از کپی های جایگاه cap ، در اکثر سویه های متعلق به گروه I مشاهده شده است (۴۶). به نظر می رسد که ایجاد این ساختار در یک باکتری اجدادی باعث ایجاد نوعی برتری تکاملی در باکتری شده و باعث گسترش آن شده است(۴۰).
در اغلب Hib های گروه I، دو کپی از جایگاه ۱۷kb وجود دارد که توسط یک پل ۱٫۲kb به یکدیگر متصل شده اند. Hib های این گروه تمایل به از دست دادن توانایی تولید کپسول دارند، به این ترتیب که در ۱- ۵/۰ موارد نوترکیبی بین این دو منطقه مشابه ، باعث از دست رفتن یکی از نسخه ها (نسخه دارای ژن bexA ) شده و باکتری توان انتقال کپسول به سطح خود را از دست می دهد(سویه Hib‾ یا b‾).
در گروه II به نظر می رسد ارتباط فیزیکی بین IS11016 و جایگاه cap وجود نداشته باشد (۴۰).
شکل ۱-۹ : درخت تکاملی^[۲۸] سویه های کپسول دار هموفیلوس آنفلونزا
۱-۹-۱-۷: ژنوتیپ های Hib
آنالیز توالی جایگاه cap در میان سویه های Hib نشان دهنده وجود تفاوت های جزئی در ژن های bcs4، hcsA و hcsB در میان سویه ها می باشد. بر این اساس دو ژنوتیپ از Hib شناسایی شده که دارای تفاوت های ساختاری و عملکردی می باشند. این تفاوت ها شامل:
SNPs^[29] - ۱۲ و حذف به اندازه ۲۴ جفت باز در ژن bcs4
SNPs - 93 در ژن hcsA
SNPs - 24 و حذف ۲۴ جفت باز در ژن hcsB
در ژنوتیپ II نسبت به ژنوتیپ I می باشد.
۲۴ جفت باز حذف در ژن bcs4 منجر به ایجاد ۸ آمینو اسید کمتر در انتهای C ترمینال محصول ژن در ژنوتیپ II می شود .حذف ۲ جفت بازی در ژن hcsB در منطقه بین دو ژن باعث تغییر کدون آغاز ATG در ژن hcsB می شود، ولی وجود یک SNP C→G یک کدون آغاز جدید به وجود می آورد. در نهایت محصول hcsB 24 جفت باز کوتاهتر می شود. نتیجه این که محصول ژن hcsB نیز در ژنوتیپ II به اندازه ۸ آمینو اسید کوتاهتر خواهد بود(شکل ۱-۱۰).
مشخص شده است که وجود تفاوت در محصول این دو ژن باعث ایجاد تفاوت در کپسول پلی ساکاریدی در این دو ژنوتیپ نمی شود
تحقیقات نشان می دهد که قطر کپسول پلی ساکارید در سویه های ژنوتیپ I و II با هم برابر است ولی میزان پلی ساکارید کپسولی موجود در سویه های ژنوتیپ I تقریبا دو برابر ژنوتیپ II می باشد، همچنین یافته های حاصل از میکروسکوپ الکترونی نشان داد که کپسول در ژنوتیپ I متراکم تر از نوع II می باشد(۶۵).
شکل۱-۱۰ : تفاوت های بین ژنوتیپ I و II در جایگاه cap: قسمت بالای تصویر نشان دهنده ساختار ژنتیکی یکی از نسخه های cap در Hib است که دارای حذف شدگی در بخشی ژن bexA و قطعه IS1016 می باشد. قسمت ابتدایی نسخه بدون حذف شدگی در سمت راست تصویر نشان داده شده است. پایین تصویر نشان دهنده ژن های bcs4، hcsA و hcsB می باشد. خطوط عمودی نشان دهنده تفاوت نوکلئوتیدها در ژنوتیپ I و II ، نقاط کروی نشان دهنده تفاوت آمینو اسید و مثلث نشان دهنده حذف شدگی می باشد.
۱-۱۰: روش های تعیین تعداد کپی جایگاه cap در ژنوم هموفیلوس آنفلونزا:
برای تعیین تعداد کپی جایگاه cap در هموفیلوس آنفلونزا تا کنون از روش های مختلفی استفاده شده است از جمله روش ساترن بلات^[۳۰]، روش PFGE^[31] و روش Real-time PCR که روش Real-time PCR به دلیل نو بودن و هزینه پایین و سرعت بالا در اولویت قرار دارد.
۱-۱۱: Real-time PCR
۱-۱۱-۱: تعریف و مفهوم :
Real-time PCR که به نام qPCR نیز معروف است یک تکنولوژی بر پایه نوکلئیک اسید است که برای شناسایی و تعیین کیفیت توالی DNA خاص به کار می رود. همان طور که از معنی واژه بر می آید مفهوم Real-time PCR مشاهده لحظه به لحظه فرایند PCR می باشد.
فرمول بندی Real-time PCR ابتدا توسط Higuchi و همکارانش به انجام رسید. در این سیستم تشخیصی یک ماده فلورسانت، در طی واکنش متناسب با میزان محصولات هر سیکل واکنش آزاد می شود و میزان فلورسنت آن توسط یک نمایانگر (detector) شناسایی و ثبت می گردد.
این مولکول های گزارش گر یا رنگ هایی هستند که به DNA دو رشته ای (برای مثال SYBR@Green) یا پروب هایی که به توالی خاصی از هدف متصل می شوند (برای مثال Probes TaqMan@).