وبلاگ

۸

۱۶

۸۰

۱

۳

۱۶-

۹

۱۶

۹۰

۱

۳

۱۶-

۳-۳-۹-۲- تمرین اکسنتریک دویدن در سراشیبی
شکل۳-۲- موش­های صحرایی در حین انجام پروتکل تمرین ورزشی
۳-۱۰- نحوه نمونه گیری و نگهداری نمونه­ها
۲۴ ساعت بعد از آخرین جلسه تمرینی ابتدا موش­های صحرایی گروه کنترل مورد نمونه گیری قرار گرفتند و ۲۴ ساعت بعد از آن­ها (۴۸ ساعت بعد از آخرین جلسه تمرین) موش­های صحرایی گروه ­های تمرین مورد نمونه گیری قرار گرفتند.
ابتدا به موش­های صحرایی به ازای هر ۱۰۰ گرم از وزنشان ۰٫۱ میلی­گرم از مخلوط (۱۰ میلی­گرم کتامین + ۱٫۵ میلی­گرم زایلوزین) تزریق شد تا بیهوش شوند. سپس برای اطمینان از کمترین آزار حیوان، ابتدا فورا با جدا کردن قلب، حیوانات معدوم شدند و بلافاصله عضلات نعلی و SVL^[53] از اندام تحتانی سمت راست استخراج شدند و سریعا در ترازوی با دقت ۰٫۰۰۰۱ گرم وزن­کشی شدند و بلافاصله بعد از قرار گیری در کرایوتیوب DNA-RNase free، درون ازت مایع قرار گرفتند. عضلات تا زمان آماده سازی نمونه در دمای ۸۰- درجه سانتی ­گراد نگهداری شدند.

شکل۳-۳- عضلات نعلی و SVL موش صحرایی
۳-۱۱- نحوه سنجش متغیر­ها
سنجش بیان ژن­های نمونه عضلانی در بخش سلولی مولکولی پژوهشکده غدد و متابولیسم دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی انجام شد.
۳-۱۱-۱- سنجش میزان تغییرات بیان ژن­ها
به منظور سنجش بیان mRNA ژن­های FOXO1، MHC I، MHC IIa، MHC IIx و MHC IIb نمونه­های عضلات استخراج شده از موش­های صحرایی که در فریزر ۸۰- آزمایشگاه دانشکده تربیت بدنی و علوم ورزشی نگهداری می­شدند توسط تانک ازت به فریزر ۸۰- پژوهشکده غدد و متابولیسم انتقال داده شدند.
۳-۱۱-۲- استخراج ^[۵۴]RNA
استخراج RNA با بهره گرفتن از روش RNX و با بهره گرفتن از محلول RNX- Plus شرکت سینا ژن (cat. N0 RN7713C) طبق پروتکل زیر انجام گرفت:
افزودن ۱ میلی­لیتر محلول RNX به ۵ – ۱۵ میلی­گرم از بافت
هموژناسیون در دستگاه هموژنایزر^[۵۵] (۵ دقیقه با سرعت ۳۰)
انکوباسیون در دمای اتاق به مدت ۵ دقیقه
افزودن ۲۰۰ میکرولیتر کلروفرم^[۵۶] و سر و ته کردن با دست
قرار دادن روی یخ به مدت ۵ دقیقه
سانتریفیوژ به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۲۰۰۰ در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد
انتقال فاز رویی به میکروتیوب جدید (حجم برداشته شده باید مشخص باشد)
افزودن حجم مساوی ایزوپروپانول^[۵۷] و سر و ته کردن با دست
قرار دادن روی یخ به مدت ۱۵ دقیقه
سانتریفیوژ به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۲۰۰۰ در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد
خارج کردن مایع رویی و نگه داشتن ته­نشین
افزودن ۱ میلی­لیتر اتانول ۷۵% و ورتکس کوتاه
سانتریفیوژ به مدت ۸ دقیقه با دور ۷۵۰۰ در دمای ۴ درجه سانتی ­گراد
خارج کردن مایع رویی و برگرداندن میکروتیوب­ها روی دستمال خشک
افزودن ۴۰ – ۵۰ میکرولیتر آب مقطر DNase (DW)
RNA استخراج شده سریعا به فریزر ۸۰- انتقال داده شد. قبل از آن با بهره گرفتن از دستگاه اسپکتوفوتومتر^[۵۸] غلظت RNA استخراج شده تعیین گردید.
۳-۱۱-۳- واکنش رونویسی معکوس^[۵۹] برای سنتز cDNA
واکنش رونویسی برای ساخت رشته اول cDNA انجام می­ شود. برای انجام این واکنش از پروتکل زیر استفده شد:
تهیه مخلوط زیر به ازای هر نمونه RNA :
۱ میکرولیتر بافر DNase I