در گزارشی از لیو و همکاران فعالیت و ساختار آنزیم لیپاز CRL انکوبه شده در ۱۷ نوع مایع یونی مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که انتخاب نوع آنیون اثر مهمتری بر فعالیت آنزیم در واکنش استریفیکاسیون داشته است و مایعات یونی محلول در آب اثر منفی بر فعالیت آنزیمی داشته اند. مطالعات ساختاری این گروه با روش FTIR تا حدودی تغییرات ساختاری مرتبط با تغییرات فعالیت آنزیم را نشان داد. هرچند افزایش فعالیت دیده شده در برخی موارد را نمی توان با داده های تجربی حاصل از بررسی ساختار ارتباط داد (Liu et al., 2013).
در بررسی ساختاری آنزیم لاکاز[۸۱] در مخلوط آبی مایعات یونی [C4MIM][TfO]، [C4MPy][TfO]، [TMA][TfO] با روشهای CD و فلورسانس اثر مثبت مایع یونی [C4MA][TfO] بر پایداری ساختاری آنزیم نسبت به دو نوع دیگر نشان داده شد. در این مطالعه نتایج مطالعات ساختاری با نتایج حاصل از بررسی فعالیت آنزیمی مطابقت داشتند (Yua et al., 2013).
در مطالعه ساختاری دیگری به کمک فلورسانس و FTIR اثر مایعات یونی ایمیدازولیومی محلول در آب بر ساختار دو آنزیم α- آمیلاز باسیلوس لیکنیفورمیس[۸۲] و آمیلولیکوئی فاسینس[۸۳] مورد بررسی قرار گرفت. این بررسی نشان داد که آنزیم α- آمیلاز در محیط بافری و محلول آبی مایع یونی [C4MIM][Cl] لخته شده و دناتوره می شود. در حالیکه محلول آبی مایع یونی [C6MIM][Cl] به طور قابل ملاحظهای مانع از دناتوره شدن آنزیم می شود (Dabirmanesh et al., 2011).
اهداف
بررسی اثر مایعات یونی مختلف روی پایداری و فعالیت آنزیم های لیپاز تا حدودی انجام شده است، اما مطالعه اثر طولهای مختلف زنجیره کاتیونی مایعات یونی روی آنزیم و بررسی چگونگی تغییر ساختار آنزیم و اثر آن بر فعالیت آنزیمی کمتر مورد توجه قرار گرفته است. همچنین با توجه به اثرات متفاوت مایعات یونی بر روی آنزیم های مختلف، در این پژوهش اثر مایعات یونی روی آنزیم لیپاز TTL، یک آنزیم گرمادوست با پتانسیل کاربردهای صنعتی، مورد بررسی قرار میگیرد. بنابراین اهداف این پژوهش عبارتند از:
بررسی اثر غلظتهای مختلف مایعات یونی بر فعالیت هیدرولازی آنزیم TTL
بررسی اثر مایعات یونی با کاتیون و آنیونهای مختلف بر پایداری دمایی آنزیم TTL
مطالعه پایداری دمایی بر اساس تغییر در ساختار سوم آنزیم TTL در حضور و عدم حضور مایعات یونی
فرضیه
با بهره گرفتن از مایع یونی مناسب به عنوان محیط واکنش میتوان به پایداری بیشتر و فعالیت بهتری از آنزیم دست یافت.
فصل سوم
مواد و روشها
۳-۱- ابزار
انواع ظروف و لوازم آزمایشگاهی (ارلن، بشر، پلیت، بورت، کندانسور و غیره)
سمپلر
ترازو حساس (MettlerToledo)
کیسه دیالیز
استیرر (Vision)
pH سنج (Metrohm)
هات بلاک (پدیده نوژن پارس)
بن ماری (ریحان طب)
آون خلاء
سیستم تغلیظ پروتئین و فیلتر مربوطه (Amicon)
هود لامینار (ژال تجهیز)
انکوباتور (ریحان طب)
شیکر انکوباتور (Vision)
سانتریفوژ (Sigma 16-P)
سانیکاتور (Bandelin Sonicator)
اسپکتروفتومتر UV-Visible (Shimadzu)
اسپکتروفتومتر فلورسانس (Perkin Elmer LS 45)
اتوکلاو (ریحان طب)
پمپ پریستالتیک (Longer Pump BT100-2J)
دستگاه Power(Paya Pajoohesh)
۳-۲- مواد
۳-۲-۱- مواد لازم جهت تهیه مایعات یونی
آلکیل هالید ها (برومواتان، بروموبوتان، بروموهگزان، برومودودکان) (Merck)
متیل ایمیدازولیوم (Merck)
آمونیوم هگزافلوروفسفات (Acros Organics)
دی اتیل اتر (Panreac)
۳-۲-۲- مواد لازم جهت تهیه آنزیم لیپاز درون سلولی TTL
۳-۲-۲-۱- سوش باکتری
باکتریxL1blue E.coli (جهت تکثیر پلازمید حاوی ژن لیپاز)
باکتری E.coli BL21 (جهت بیان پروتئین)
۳-۲-۲-۲- مواد مورد نیاز برای ترانسفورماسیون
پلازمید حاوی ژن لیپاز درون سلولی TTL (pQE-TTL)
KCM (KCl, CaCl2, MgCl2)
آب مقطر استریل
۳-۲-۲-۳- مواد مورد نیاز برای کشت باکتری و استخراج عصاره سلولی
تریپتون، عصاره مخمر، نمک سدیم کلرید (Merck) (جهت تهیه محیط LB (Louria Bertoni))
آگار (Merck)
آنتی بیوتیک آمپی سیلین
ایزوپروپیل β-D- تیوگالاکتوزید (IPTG) (سیناژن)
آنزیم لیزوزیم (CinnaGen)
بافر تریس (Merck)
سدیم فسفات (Merck)
۳-۲-۲-۴- مواد مورد نیاز برای تخلیص آنزیم لیپاز
رزین Q- Sepharose
رزین Gel filtration
فرم در حال بارگذاری ...
