وبلاگ

۹۳- (ADH)
۹۴- (EDAC)
۳-۲-۱- تهیه میکروارگانیسم های به کار گرفته شده در این مطالعه:
سویه باکتری همو فیلوس آنفولانزای تیپ b با شماره PTCC 1623 برای تهیه PRP استفاده شد و از کلکسیون میکروبی بخش واکسن های میکروبی و تهیه آنتی ژن انستیتو پاستور ایران تهیه شد.

۳-۲-۲-باز کردن سویه باکتری همو فیلوس آنفولانزای تیپ b لیوفیلیزه و کشت آن :
برای بازکردن هر سوش لیوفیلیزه دستور خاصی وجود دارد، در مورد سوش همو فیلوس آنفولانزای تیپ b با شماره PTCC 1623 ابتداcc /05 محیط BHI broth تزریق شد. سپس، در ٣ مرحله در محیط کشت BHI broth کشت داده شد. این کشت ها در زمان های متفاوتی انجام شدند. در مرحله اول ۲ ساعت، مرحله دوم ۱ ساعت و در مرحله سوم محیط کشت BHI broth ٣ ساعت در درون انکوباتور در دمای ٣٧ درجه سانتیگراد انکوبه میکنیم،بعد از ۶ساعت باکتری فعال می شود. با سرنگ مقدرای از سوشهایی که در محیط مایع BHI broth رشد کرده به داخل پلیت های شکلات آگار (۳ عدد) می ریزیم و سپس کشت انبوه می دهیم و در داخل گرماخانه در ۳۷^c قرار می دهیم. بعد از رشد در این محیط برای حصول از اطمینان سالم بودن از محیط کشت از این سه پلیت رنگ آمیزی گرم حاصل می شود تا از آلوده شدن آن به میکروارگانیسمهای دیگر اطمینان حاصل شود. در این مرحله ماکلنی تک می گیریم بدین ترتیب که از یکی از سه پلیت قبلی که اطمینان حاصل شده سالم است مقداری باکتری برداشته و در پلیت جدید کشت خطی می دهیم تا کلنی تک بگیریم. سپس بعد از کشت خطی پلیت را در داخل گرماخانه قرار می دهیم. کلنی های هموفیلوس آنفلوآنزا ظرف ۱۲-۸ ساعت رشد می کنند. بدین ترتیب کلنی تک بدست می آوریم.جهت اطمینان از سالم بودن پلیت فوق رنگ آمیزی گرم به عمل می آید. برای اینکه مطمئن شویم سوش کپسول دار است باید تست آکروفلاوین انجام دهیم، به این صورت که مقداری از کلنی برداشته و بر روی لام با سرم فیزیولوژی حل کرده، سپس یک قطره آکروفلاوین به آن اضافه می کنیم اگر سوش smoth باشد نباید آگلوتیناسیون اتفاق بیفتد
شکال۳-۱- باز کردن سویه PTCC هموفیلوس آنفلوانزا
۳-۲-۳-فرآوردن و تخلیص PRP
برای رسیدن به توده سلولی مورد نیاز جهت تولید PRP به میزان مناسب،برای رسیدن به حجم بالایی از محیط کشت از فرمانتور استفاده شد که مراحل کشت در فرمانتو به این ترتیب است : ابتدا تهیه بذر سپس تیمار عصاره مخمر، در ادامه آماده سازی ، نمونه گیری از فرمانتور و مراحل خالص سازی PRP .
۳-۲-۴- تهیه بذر محیط کشت
در ابتدا باید بذر باکتری آماده گردد و سپس فرمانتور برای تخلیص پلی ساکارید آماده گردد. برای همین منظور از کشت تازه باکتری استفاده کردیم.محتویات بذر مورد نظر به ترتیب زیر برای حجم ۱ لیتر بذر،تهیه شد.
گلوکز: ۲۰ گرم ( شرکت مرک)
گاردن پی پپتون: ۱۰ گرم (شرکت فلوکا)
سیستئین: ۰۴/۰ گرم (شرکت مرک)
تریپپتوفان: ۰۵/۰ گرم (شرکت مرک)
فسفات دی هیدروژن سدیم: ۱ گرم (شرکت مرک)
دی فسفات هیدروژن سدیم ۱۲ مولکول آب: ۲۰ گرم (شرکت مرک)
سولفات آمونیوم: ۲گرم (شرکت سیگما)
سولفات منیزیم ۷ مولکول آب: ۲/۰ گرم (شرکت مرک)
کلرید کلسیم ۲ مولکول آب: ۰۵/۰ گرم (شرکت سیگما)
عصاره‌ی مخمر دیالیز شده: ۲۰ سی سی
نیکوتین آمیددی نوکلئوتید (NAD): 2 میلی گرم (شرکت مرک)
پروتوپورفیرین (Hemine): 1 میلی گرم (شرکت سیگما)
همچنین NAD و Hemine باید بعد از اتوکلاو شدن محیط بذر به صورت فیلتر شده اضافه شوند، چون توسط اتوکلاو شدن از بین می روند.تمام مواد بالا را در یک لیتر آب مقطر حل کرده و سپس اتوکلاو انجام میشود. باید به این نکته نوجه کنیم که چون عصاره مخمر دارای مقادیر حائز اهمیتی پلی ساکارید می باشد که موجب اختلال در فرایند تخلیص پلی ساکارید می کند،این پلی ساکارید باید تا حد امکان حذف گردد وبا اصلاح عصاره مخمر تیمار شود.باکتری کشت داده شده با ۲۰ میلی لیتر محیط بذر شستشو وسپس به محیط کشت بذرمنتقل می‌شود. سپس بذر در انکوباتور شیکردار با ۷۰ دور در دقیقه و دمای ۳۷ درجه به مدت ۲۴ ساعت قرار می‌دهیم. تا باکتری رشدکند و محیط کدر شود. زمانی که جذب نوری این محیط در طول موج ۶۰۰ نانومتر به حدود ۴/۰-۵/۰ برسد نشان می دهد که باکتری به فاز رشد لگاریتمی رسیده این مرحله از رشد برای تلقیح محیط بذر به محیط کشت اصلی( فرمانتور ) مناسب است.
۳-۲-۵-تیمار عصاره مخمر:
۱۰۰ گرم پودر عصاره مخمر را در ۲۰۰سی سی آب مقطر حل کرده،برای یکنواخت شدن آن به همراه مگنت روی استیرر بدون حرارت قرار می گیرد.سپس عصاره مخمر را به کیسه های دیالیز با cutoff ، ۱۰هزار که از قبل جوشانده بودیم(برای فعال شدن کیسه ی دیالیز) ریخته و بر علیه ۵ لیتر آب مقطر با دمای ۴درجه بود قرار گرفته ،داخل آلونژ یک عدد مگنت انداخته و آلونژ را بر روی استیرر و در یخچال قرار دادیم. آب جدید باید هم دمای آب قبلی باشد تا به پروتئن های عصاره مخمر آسیب نرسد و هر سه ساعت یک بار آب مقطر آلونژ را تعویض کردیم.تعویض را تا جایی انجام میدهیم که دیگر رنگ آب مقطر آلونژ تغییری نکند.برای مطمئن شدن از تکمیل مرحله دیالیز می توان از تست فتل اسید سولفوریک استفاده کرد.که اگر رنگ آب مقطر آلونژ با این قسمت قهوه ای شد یعنی حاوی پلی ساکارید است،و یا اینکه مایع آلونژ را در دستگاه اسپکتوفتومتری قرار داده و در طول موج ۵۷۰ نانومتر،میزان جذب را قرائت کرده اگر جذبی مشاهده شد یعنی پلی ساکارید در داخل آب مقطر آلونژ وجود دارد.

شکال۳-۲- تیمار عصاره مخمر . چپ: تغییر رنگ آب در روز اول دیالیز عصاره مخمر.راست: روز سوم دیالیز عصاره مخمر بدون تغییر رنگ آب
۳-۲-۶-آماده کردن فرمانتور و تلقیح بذر :
جهت کشت باکتری از فرمانتور نوع کویل با مخزن شیشه ای و حجم ۶۰ لیتر ،ساخت شرکت Novo-Paljas
کشور هلند استفاده کردیم.
شکال۳-۳- فرمانتور Novo-Paljas کشور هلند
ابتدا ۸ لیتر محیط کشت بذر با بهره گرفتن از فشار مثبت و عبور از فیلتر با قطر منافذ ۴۵/۰ مایکرومتر،محیط به مخزن فرمانتور منتقل کردیم و حدود ۴ لیتر آب سرد به آن اضافه کرده،چون برای استفاده از فرمانتور بایدتمام مسیرهای ورودی و خروجی استریل شوند. فرمانتور را روشن، خروجی ها و ورودی های آن را در ۱۲۱ درجه سانتی گراد با بخار حاصل از محیط کشت استریل کردیم. به مدت ۱۵ دقیقه بخار از لوله های ورودی و خروجی آن عبور کرد. بعداز استریل شدن لوله ها، شیلنگ های ورودی و خروجی،سر این ها با کلیپس بسته شد تا آلوده نشوند. پس از این مخزن سرد شد، دما را روی ۳۷ درجه و فشار را روی ۲/۰ بار تنظیم کردیم و به مدت ۲۴ ساعت زمان می دهیم تا مطمئن شویم آلودگی ندارد. بعد از گذشت این زمان و در صورت شفاف بودن محیط، بذر را از انکوباتور شیکردار خارج کرده و حجم ۱ لیتر محیط بذر را به محیط کشت منتقل کردیم، دمای فرمانتور ۳۷ درجه سانتی گراد وPH روی ۴/۷ و ۶/۷ تنظیم شد. همچنین حدود cc 20 NAD و Hemin به فرمانتور منتقل کردیم .زمانی که PH محیط کاهش یابد سود ۵ نرمال به صورت خودکار اضافه می شود تا با کاهش PH محیط باکتری از بین نرود.

شکال۳-۴- راست: اضافه کردن عصاره مخمر و فاکتور رشد – چپ : اضافه کردن بذر به محیط کشت
۳-۲-۷-نمونه گیری از فرمانتور
برای اینکه بدانیم باکتری در چه مرحله ای از رشد است هر ۲ ساعت یک بار از فرمانتور نمونه گیری و OD آن را در ۵۶۰ نانو متر میخوانیم.ابتدا قبل از وارد کردن محیط بذر به محیط فرمانتور یک نمونه گیری انجام داده و به عنوان زمان صفر در نظر میگیریم و OD آن را قرائت میکنیم. اما در مراحل بعدی رشد از محیط کشت به عنوان بلانک استفاده شد.همچنین از محتویات فرمانتور با تهیه لام و رنگ آمیزی گرم از رسوب آن می توان از خالص بودن کشت داخل فرمانتور مطمئن شویم.در زمان های صفر، ۲، ۴، ۶ ساعت از فرمانتور نمونه گرفتیم و OD آن را خواندیم.که تا ۴ ساعت بعد از آن افزایش OD مشاهده شد که نشان دهنده ی رشد لگاریتمی است. اما از ساعت چهارم تا ۶ ساعت بعد از آن افزایش زیادی در OD مشاهده نشد که نشان دهنده ی پایان فاز سکون و شروع فاز مرگ باکتری است. همچنین برای اطمینان حاصل کردن سود را هم قطع کرده چون تغییر زیادی در PH محیط مشاهده نشد.پس فرمانتور را خاموش می کنیم.
بعد از حدود ۶ ساعت رشد باکتری و مرحله لگاریتمی آن کامل شد ، محتویات فرمانتور را تخلیه و به آن حدود ۲۰۰سی سی اتانول ۶% اضافه کرده و یک شب در دمای ۴درجه نگه داشتیم.
۳-۲-۸- مرحله رسوب دهی الکلی
به منظور جداسازی محیط کشت و توده سلولی محتوی فرمانتور را به مدت یک ساعت در ۳۵۰۰ دور سانتریفوژ کردیم.سوپر ناتانت را جمع آوری و سلول های ته نشین شده را دور ریختیم.سانتریفوژ باعث جدا شدن کپسول باکتری از سلول شده و در فاز مایع حل می گردد.
۳-۲-۹- مرحله الکل زنی
سوپرناتانت را جمع آوری شده را به مدت یک شب در یخچال با دمای ۴ درجه نگه داشتیم. به ازاء هر ۵/۲ لیتر سوپرناتانت حدود ۶ لیتر و ۷۵۰سی سی اتانول ۹۶% اضافه شد. بعد از اضافه کردن الکل به سوپرناتانت، سوپرناتانت را به مدت یک شب در دمای ۴درجه نگه میداریم، سپس بعد از یک شب، ظرف های شیشه ای را از یخچال خارج کرده PH آن را اندازه میگیریم(۳/۷)، بعد به آن گلاسیال استیک اسید اضافه و PH آن روی ۸/۶ تنظیم شد. و دوباره به مدت ۲۴ ساعت آن را در دمای ۴ درجه نگه داری می کنیم تا پلی ساکارید ها رسوب کنند.
شکال۳-۵- رسوب حاصل از الکل زنی
۳-۲-۱۰- مرحله شست و شو با کلریدمنیزیم:
بعد از ۲۴ ساعت، محتویات آلونژ هارا به مدت ۱ ساعت با دور ۳۰۰۰ سانتریفوژ کرده، سوپر ناتانت را دور ریخته و رسوب حاصل را نگه داشته و حدود ۸/۱ لیتر کلرید منیزیم ۶ ملکول آب با غلظت ۰۵/۰ مولار به آن اضافه کرده و خوب مخلوط میکنیم تا بطور کامل رسوبات حل شوند و آن را به مدت ۱ساعت با دور ۳۰۰۰ سانتریفوژ میکنیم.رسوبات را دور ریخته و سوپر ناتانت را نگه میداریم.
۳-۲-۱۱- تیمار با ستاولن:
سوپرناتانت جمع آوری شده حدود ۵/۲ لیتر بوده که با حدود ۱۰۰سی سی ستاولن ۲% ( سیگما) مخلوط میکنیم و یک شب در دمای ۴ درجه نگه میداریم.پس از یک شب محلول را به مدت ۱ساعت در ۳۰۰۰ دور سانتریفوژ کرده، رسوب را نگه داشته ، سوپر ناتانت را دور میریزیم.
۳-۲-۱۲- افزودن فسفات سدیم
رسوبات را با حدود یک لیتر فسفات سدیم ۷/۰مولار حل کرده، محلول را به مدت ۱ساعت در ۳۵۰۰ دور سانتریفوژ کردیم ، سوپر ناتانت را از رسوبات جدا کرده، حدود ۹۳۰سی سی سوپر ناتانت حاصل شد.
۳-۲-۱۳- مرحله الکل زنی مجدد:
چون در مرحله اول الکل زنی به ازاء هر لیتر حدود ۲لیتر و ۶۰۰سی سی اتانول ۹۶% اضافه شد این بار هم حدود ۲لیتر و ۴۱۸سی سی اتانول ۹۶% به سوپر ناتانت که حدود ۹۳۰سی سی بود اضافه شد. و این محلول را به مدت یک ساعت در دمای آزمایشگاه نگه داشتیم و سپس در یخچال به مدت یک شب قرار دادیم.
۳-۲-۱۴- تیمار با هیدروکسیل آپاتیت:
سپس محلول را به مدت ۱ساعت در ۳۵۰۰ دور سانتریفوژ کردیم و به رسوب ایجاد شده حدود cc900 محلول هیدروکسیل آپاتیت ۱/۰ درصد (Merck) اضافه شد تا بطور کامل حل شوند، سپس به مدت ۱ساعت با ۳۵۰۰ دور سانتریفوژ انجام می دهیم، به رسوبات حاصل شده از سانتریفوژ حدود ۵۰۰سی سی محلول استات سدیم ۵/۰مولار (Merck) اضافه کرده و به مدت یک شب در یخچال قرار میدهیم. پس از یک شب حدود ۵ گرم سدیم دزوکسی کلات (Merck) اضافه ، حدود ۲ساعت در یخچال آن را نگه داشته، بعد محلول را به فالکن های ۵۰سی سی منتقل و به مدت نیم ساعت ا دور ۹۰۰۰ سانتریفوژ کرده، سوپر ناتانت را جمع آوری، فیلتر و سپس لیوفیلیزه کردیم.