وبلاگ

مثبت:ظهور رنگ صورتی تا قرمز
منفی:تغییر رنگی صورت نمی گیرد
محیط کشت SIM(SH2-Indol-motility):
برای تفکیک باسیل‌های روده ای بر اساس تولید سولفید هیدروژن ، تشکیل اندول و حرکت به کار می رود. با بهره گرفتن از این محیط سه خصوصیت مختلف باکتری را می توان سنجید و در تمام باکتری‌ها می توان به کار برد. به طریقه (کشت عمقی ( Stab:تا یک سانتی متری انتهای لوله به وسیله آنس نوک تیز در این محیط کشت می دهیم.

روش کار
مواد اولیه تولید اندول یعنی اسید آمینه تریپتوفان در پپتون‌های محیط موجود است. سولفید هیدروژن و سولفات نیز در محیط موجود است. قوام نیمه جامد بودن محیط نیز اجازه پخش شدن و در نتیجه کدر نمودن محیط را به باکتری‌های متحرک می دهد.
ایجاد سولفید هیدروژن توسط باکتری به صورت سیاه شدن ظاهر می گردد و در صورت متحرک بودن باکتری کشت شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است، انتشار می یابد. سیاه شدن محصول واکنش سولفید هیدروژن تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه رنگ می باشد. با اضافه کردن یک میلی لیتر معرف کواکس(Kovac`s) به کشت ۲۴ ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید اندول توسط باکتری است. باکتری‌های که حاوی مجموعه آنزیم‌هایی که اصطلاحا تریپتوفاناز نامیده می گردند، باشند، قادرند طی یک سری واکنش‌های شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند.
حرکت باکتری به واسطه پخش شدن آن از مسیر خط کشت به اطراف و کدر نمودن محیط مشخص می گردد. باکتری‌های فاقد حرکت تنها مسیر خط کشت را که نمایان است، کدر می کنند. برای تعیین تولید اندول می توان از محیط تریپتوز نیز استفاده نمود[۷۸].
۲-۵-۳- محیط کشت TSI(Triple Sugar iron agar)
از این محیط جهت تعیین هویت باکتری‌های گرم منفی استفاده می شود. همچنین برای تعیین تولید H2S به کار می رود. این محیط دارای سه قند گلوکز، سوکروز و لاکتوز می باشد. مقدار کمتر گلوکز در قیاس با دو قند دیگر تمایز باکتری‌ها را در تخمیر قندهای مختلف ممکن می سازد. آهن موجود در محیط گاز سولفید هیدروژنی را که از مواد گوگرد دار تولید می شود را به دام انداخته و مانع از خروج این گاز از محیط می شود. این واکنش به صورت رنگ سیاه که همان سولفور آهن است، مشخص می گردد. تولید سولفید هیدرژن به عنوان اولین قدم در شناسایی باسیل‌های گرم منفی به کار می رود.
روش انجام کار
با بهره گرفتن از آنس سوزنی استریل خنک، رشد را از مرکز یک کلونی که به تازگی روی پلیت محیط مورد استفاده برای کشت انتروباکتریاسه رشد کرده است، به سطح شیب دار TSI Agar انتقال و با حرکت آنس در امتداد سطح شیب دار، کشت داده شد و سپس عمق با سوراخ کردن محیط، تلقیح گردید. لوله‌ها با درپوش‌های شل شده به مدت ۲۴-۱۸ ساعت در دمای ۲+_۳۵ در اتمسفر هوازی انکوبه گردید. اگر محیط در عمق لوله زرد شود(اسیدی) اما در سطح شیب دار قرمز شود(قلیایی)، ارگانیسم تحت بررسی فقط دکستروز(گلوکز)را تخمیر می کند.
رنگ زرد(اسیدی) در سطح شیب دار و عمق نشان می دهد که ارگانیسم تحت بررسی، دکستروز، لاکتوز و یا ساکاروز را تخمیر می کند.
رنگ قرمز(قلیایی) در سطح شیب دار و عمق نشان می دهد که ارگانیسم تحت بررسی، یک غیر تخمیر کننده(Nonfermenter) است.
تولید سولفید هیدرژن سبب تولید رسوب سیاه در عمق لوله می شود.
تولید گاز با شکاف و ترک خوردگی محیط نشان داده می شود[۷۸].
۲-۵-۴- محیط اوره(Urea agar)
این محیط کشت جهت تفکیک ارگانیسم‌ها به ویژه انتروباکتریاسه بر اساس تولید اوره آز به کار می رود. اوره آز آنزیمی است که بعضی از ارگانیسم‌ها آن را تولید کرده و اوره را به دی اکسید کربن، آب و آمونیاک هیدرولیز می کنند. آمونیاک در محلول به کربنات آمونیوم تبدیل شده و باعث قلیایی شدن محیط و بالا رفتن PH می شود.
روش انجام کار
باکتری در محیط اوره که دارای معرف فنل رد می باشد به صورت مایع یا آگار کشت داده شد. پس از ۱۸ تا ۲۴ ساعت در صورتی که باکتری قادر به شکستن اوره باشد با تولید آمونیاک باعث قلیایی شدن محیط و موجب تغییر رنگ معرف فنل رد از رنگ قرمز به رنگ ارغوانی پر رنگ شد. PH محیط در این صورت بیشتر از ۸/۴ بود [۷۸].
۲-۵-۵- محیط کشت مورد استفاده جهت تعیین ESBLs و سنجش حساسیت باکتری‌ها نسبت به آنتی بیوتیک‌ها:
محیط کشت مولر-هینتون آگار(Muller Hinton Agar):
این محیط کشت در اصل برای جداسازی گونه Neisseria بیماری زا فرموله شد.امروزه بیشتر در ارتباط با دیسک‌های آنتی بیوتیکی با توان(Potency)بالا، برای تعیین الگوهای حساسیت آنتی بیوتیکی با تکنیکKirby-bauer (کرابی-بایر) به کار می رود. مولر هینتون یک محیط شفاف و مفید برای تعیین حساسیت ارگانیسم‌ها نسبت به آنتی بیوتیک است. این محیط همچنان برای آزمایش هیدرولیز نشاسته مفید است [۷۸].
۲-۶- روش اجرای کار
۲-۶-۱- جمع آوری نمونه‌ها
از آزمایشگاه بیمارستان‌های شهید صدوقی و شهید رهنمون و سوانح سوختگی شهر یزد نمونه‌های باسیل‌های گرم منفی ایزوله شده ازنمونه‌های مختلف ( زخم، خون، ادرار، ترشح ریه، …..) بیماران بستری را جمع آوری کرده و بعد از تکمیل کردن پرسشنامه ( شامل اطلاعات دموگرافیک مانند نام ، سن، جنس، بیمارستان، بخش، نوع نمونه و اطلاعات مربوط به آزمایشگاه شامل: حضور آنزیم ESBLs و نتایج آنتی بیوگرام) ، نمونه‌ها را به آزمایشگاه دانشکده پزشکی منتقل نموده و پس از کشت در محیط EMBبه وسیله روش های بیوشیمیایی و رنگ آمیزی گرم باکتری‌ها را تعیین هویت کرده تا جائیکه ۱۱۸ سویه از K.pneumoniae بدست آید. محیط‌های کشت مورد استفاده در آزمایشات بیوشیمیایی عبارت بودند از: محیط کشت TSI ( جهت بررسی تخمیر قند‌های گلوکز، لاکتوز و سورکروز)، محیط کشت SIM ( جهت بررسی تولید ایندول از تریپتوفان، حرکت و تولید سولفید هیدروژن)، محیط سیمون سیترات ( جهت بررسی استفاده از سیترات)، محیط MR-VP ( جهت بررسی تولید اسید‌های مخلوط و یا بوتیلن گلیکول از تخمیر گلوکز)، محیط اوره ( جهت بررسی تولید اوره آز) کلیه محیط‌های کشت مورد استفاده جهت کشت نمونه، تعیین هویت باکتری ساخت شرکت Merck کشور آلمان بود.
۲-۶-۲- سنجش حساسیت باکتری نسبت به آنتی بیوتیک‌ها
جهت تعیین حساسیت به آنتی بیوتیک‌های جنتامایسین(۱۰ μg )- سیپروفلوکساسین( ۵ μg)- کوتریموکسازول(۳۰ μg)- آموکسی سیلین /کلاولانات(۲۰ μg)- آمپی سیلین(۲۵ μg)- ایمی پنم(۱۰ μg)- پیپراسیلین(۱۰۰ μg)- سفپیم(۳۰ μg)- سفتازیدیم(۳۰ μg) و سفوتاکسیم۳۰ μg)) (پادتن طب- ایران) از روش استاندارد دیسک دیفیوژن (Kirby-bauer) براساس پروتکل‌های CLSI استفاده شد [۷۹]. در این روش سوسپانسیون باکتریایی با غلظت معادل کدورت لوله نیم مک فارلند( ۱۰^۸*۵/۱ باکتری ) بوسیله سواپ استریل بروی محیط کشت مولر هینتون اگار ( شرکت مرک المان) بصورت چمنی کشت داده شد و دیسک‌های حاوی انتی بیوتیک به فاصله ۲۴ میلیمتر از یکدیگر و ۱۵ میلیمتر از کناره پلیت بروی پلیت حاوی محیط مولر هینتون گذاشته شد. بعد از گرمخانه گذاری در ۳۷ درجه سانتی گراد بمدت ۲۴-۱۸ ساعت، قطرهاله عدم رشد باکتری در اطراف دیسک با خط کش اندازه گیری شده ( بصورت میلیمتر) و با مراجعه به جدول شرکت سازنده دیسک بصورت کیفی حساس، نیمه حساس و مقاوم تبدیل گردیدند. جهت کنترل از سویه استاندارد E.coli ATCC25922 استفاده شد [۷۹] و جهت تعیین وجود آنزیم ESBLs از روش Double Disk Synergy Test (DDST) که توسط Jarleir [80] شرح داده شده است استفاده گردید. در این تست سینرژی بین دیسک‌های حاوی سفوتاکسیم و اموکسی سیلین+ کلاولانات ( شرکت Mast کشور انگلستان) بررسی گردید.
در این روش بعد از اینکه سوسپانسیون باکتریایی با کدورت معادل ۵/۰ مک فارلند در سطح محیط کشت مولر هینتون بصورت چمنی داده شد، دیسک‌ها ی ذکر شده به فاصله۲۰ میلیمتر از یکدیگر بروی محیط گذاشته شده و پلیت بمدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری گردید. سپس افزایش‌هاله عدم رشد بین دو دیسک مورد بررسی قرار گرفت.درصورتیکه‌هاله عدم رشد بین دو دیسک نسبت به اطراف دیسک‌ها افزایش داشته و از حالت دورانی خارج گردید (سینرژیسم) از نظر وجود آنزیم مثبت در نظر گرفته شد.
۲-۷- آنالیز آماری
پس از جمع آوری داده‌ها و ورود اطلاعات به نرم افزار(SPSS18) کنترل‌های لازم انجام شده و توسط نرم افزار مربوطه تحت ازمون کای اسکوار و آنالیز واریانس قرار گرفتند و با بکارگیری آمارهای توصیفی مانند درصد ، میانگین و…. تجزیه و تحلیل شدند. سطح معنی دار آزمون ۰۵/۰ جهت تفسیر داده‌ها مورد استفاده قرار گرفت.
۲-۸- محدودیت و مشکلات اجرایی طرح
۱-دشوار بودن تهیه دیسک‌های آنتی بیوگرام مورد استفاده در تعیین آنزیم ESBLs
۲-هزینه بر بودن و محدودیت‌های مالی
۲-۹- متغیرها