وبلاگ

۲-۱۰-۳-۸-۲ اثرات سیتوکنین‏ها بر کشت بافت
سیتوکنین‏ها غالبا برای تحریک رشد ونمو به کار می روند. این هورمون ها بویژه اگر توام با یک اکسین اضافه شوند، باعث تحریک تقسیم سلولی می شوند (پیریک، ۱۹۸۴). از بین سیتوکنین ها، کینتین^[۱۴۳] و بنزیل آدنین^[۱۴۴] (BA) بیشتر استفاده می شوند و ^[۱۴۵]۲ip و Zeatin کمتر استفاده می شوند (واسیل و تروپ، ۱۹۹۸). سیتوکنین ها در غلظت های بالا (۱ تا ۱۰ میلی گرم در لیتر) باعث تشکیل ساقه های نابجا می شوند اما معمولا از تشکیل ریشه ممانعت می کنند (تورس، ۱۹۸۹).

۳-۱۰-۳-۸-۲ اثر اسید ‏جیبرلیک بر کشت بافت
این گروه شامل بیش از ۱۰۰ ترکیب است که GA3 رایج ترین آنها در گیاهان است. اسید جیبرلیک به ندرت در ﻛﺸﺖ ﺑﺎﻓﺖ اﺳﺘﻔﺎده ﻣﻲ ﺷﻮد . ﻧﻘﺶ اﺳﻴﺪ جیبرلیک ﻋﻤﻮﻣﺎً در ﺗﺤﺮﻳﻚ ﺟﻮاﻧﻪ زﻧﻲ ﺑﺬر و ﺗﺤﺮﻳﻚ رﺷﺪ طولی میان گره ها است. ﺑﻪ ﻃﻮر ﻛﻠﻲ اﺛﺮ اﻳﻦ ﻫﻮرﻣﻮن در ﻣﺤﻴﻂ ﻫﺎی ﻛﺸﺖ، ﺗﺤﺮﻳﻚ ﻃﻮﻳﻞ ﺷﺪن ﺷﺎﺧﺴﺎره‏ﻫﺎی کوتاه که بعد از آن منجر به تولید ریشه های نابجا می شود.
۴-۸-۲ آگار
آگار به عنوان عامل ژل کننده در کشت بافت استفاده می شود و یک پلی ساکارید مرکب با جرم مولکولی بالا است که قدرت ژل کنندگی بالائی در محیط کشت دارد. این ماده یکی از مشتقات دیواره سلولی گروهی از جلبک های قرمز (Rhodophyceae) و نوعی علف دریایی (Gracilaria) است. غلظت آگار بین ۴ تا ۷ گرم در لیتر متغیر است. غلظت آگار بر تعداد شاخساره و شیشه‏ای شدن کشت اثر دارد. درصد کشت های شیشه ای شده با سطوح بالاتر آگار کاهش می یابد. اگر غلظت آگار پایین باشد، میزان رطوبت محیط افزایش یافته و بافت های گیاهی رطوبت بالایی را جذب می کنند. در این مواقع بافت ها حالت شفافیت پیدا کرده و شیشه‏ای شدن^[۱۴۶] اتفاق می افتد. بروز این پدیده در کشت بافت نامطلوب است و گیاه به حالت طبیعی بر نمی گردد (دانشور^[۱۴۷]، ۱۹۹۲).
۵-۸-۲ کشت ریزنمونه
۱-۵-۸-۲ پرآوری شاخساره
کشت نوک شاخساره که جهت پرآوری شاخساره به کار گرفته می شود، یکی از فنون تجاری مهم برای ریزافزائی گیاهان است. ریزنمونه ها در ابتدا با طویل شدن شاخساره انتهایی اصلی همراه با پرآوری محدود شاخساره‏های جانبی رشد می کند تا تولید توده ای از ریز شاخساره‏ها نماید که شمار آنها بستگی به نوع گیاه خاص دارد (هارتمن و همکاران، ۱۹۹۱). تحریک پرآوری شاخساره‏های جانبی، بیشتر بوسیله کنترل غلظت و نسبت سایتوکینین به اکسین انجام می شود. برای این منظور مقدار متوسطی از سیتوکینین به کار می رود (۵/۰ تا ۱ میلی گرم در لیتر) و مقدار اکسین می بایستی بسیار کم در نظر گرفته شده (۰۱/۰ تا ۱/۰ میلی گرم در لیتر) و یا به طور کلی حذف شود (هارتمن و همکاران، ۱۹۹۱). اوچات و همکاران^[۱۴۸] (۲۰۱۰) پس از بررسی که روی جوانه جانبی گیاه نخود شیرین انجام دادند گزارش دادند که بیشترین پرآوری شاخه در محیط کشت MS همراه با ۱ میلی گرم در لیتر BAP ایجاد شد. آنها گزارش دادند که چون نخود شیرین به طور کلی غالبیت انتهایی قوی دارد و در رشد شاخساره های جانبی مداخله می کند، بهتر است از جوانه های جانبی به منظور پرآوری استفاده شود. ساگلام^[۱۴۹] (۲۰۱۲) با بهره گرفتن از گره کوتیلدونی در محیط کشت MS حاوی BA به تنهایی یا همراه با NAA ، تولید شاخه را در Lathyrus ochrus بررسی کرد. وی گزارش داد که بیشترین تعداد شاخه در محیط کشت حاوی ۳/۰ میلی گرم در لیتر BA + 2/0 میلی گرم در لیتر NAA بدست آمد. دمیربگ- ساهین و همکاران^[۱۵۰] (۲۰۰۸) پرآوری شاخساره های جانبی از جنین نابالغ گیاه Lathyrus cicero را بررسی کردند و گزارش دادند که بیشترین تعداد شاخساره (۲۵/۱۶) در محیط کشت MS حاوی ۴۵/۰ میلی گرم در لیتر TDZ^[151] + ۴/۰ میلی گرم در لیتر اسید آسکوربیک پس از گذشت ۸ هفته بدست آمد. آنها همچنین گزارش دادند که بلندترین شاخساره (۲۶/۸ سانتیمتر) در محیط کشت MS حاوی ۴ میلی گرم در لیتر BAP + 5/0 میلی گرم در لیتر NAA مشاهده شد. بارپت و همکاران^[۱۵۲] در سال (۲۰۱۴) گزارش دادند که پرآوری Lathyrus sativus از گره جنینی در محیط کشت MS حاوی TDZ به تنهایی یا همراه با IBA نسبت به ۲ip به تنهایی یا همراه با IBA بسیار بیشتر رخ می دهد. بیشترین تعداد شاخساره (۳۱ عدد در هر ریزنمونه) در محیط کشت MS حاوی ۱ میلی گرم بر لیتر TDZ + 1/0 میلی گرم بر لیتر IBA بدست آمد و بلند ترین شاخساره (با طول ۱/۸ سانتیمتر) در محیط کشت MS با ۵/۰ میلی گرم در لیتر ۲ip + 1/0 میلی گرم در لیتر IBA مشاهده شد.
۲-۵-۸-۲ اندام زایی مستقیم
مالیک و همکاران^[۱۵۳] (۱۹۹۳) اندام زایی مستقیم را در گونه‏های جنس Lathyrus مورد بررسی قرار دادند. آن‏ها گزارش دادند که بهترین تیمار های تولید شاخه به روش مستقیم در گونه L.cicera، محیط کشت MS حاوی ۱۰ میکرو مولار TDZ و ۵۰ میکرو مولار BAP به مدت ۳ هفته بود. در بررسی گونه L.ochrus غلظت های ۳۰ میکرو مولار TDZ و ۸۰ میکرو مولار BAP بیشترین تعداد شاخه را تولید کردند. مناسب‏ترین تیمارها جهت تولید شاخه در گونه L.sativus، ۵۰ میکرو مولار TDZ و ۸۰ میکرو مولار BAP بود و در گونه L.tingitanus تیمارهای ۱۰ میکرو مولار TDZ و ۵۰ میکرومولار BAP بیشترین شاخه را تولید کردند. آیکان و همکاران^[۱۵۴] (۲۰۱۴) بهتربن فاصله ریز نمونه ها از هم در یک پتری دیش جهت اندام زایی مستقیم در گونه L.chrysanthus را مورد بررسی قرار دادند. آنها گزارش دادند که با قرار دادن ریز نمونه های کوتیلدون در محیط کشت MS با ۲۵/۰ میلی گرم در لیتر BAP + 05/0 میلی گرم در لیتر NAA به فاصله ۱×۱ سانتیمتر بیشترین تعداد شاخساره بدست آمد. باریک و همکاران^[۱۵۵] (۲۰۰۶) گزارش دادند که به منظور اندام زایی مستقیم در گونه L.sativus از ریزنمونه اپیکوتیل^[۱۵۶]، بهترین تیمار شاخه زایی (۸ شاخه در هر ریزنمونه) محیط کشت MS حاوی ۴ میلی گرم در لیتر BA + 2 میلی گرم در لیتر NAA بود و میانگین طول شاخه‏های بدست آمده ۴ سانتیمتر بود. کندیرا و همکاران^[۱۵۷] (۲۰۰۹) گزارش دادند که در گونه L.sativus، TDZ نسبت به ترکیب BAP و NAA در تولید شاخساره موثر تر بود و بهترین تیمار برای تولید شاخساره از جنین کشت شده در شرایط درون شیشه‏ای، تیمار محیط کشت MS حاوی ۴۵/۰ میلی گرم در لیتر TDZ + آسکوربیک اسید بود.
۳-۵-۸-۲ تشکیل کالوس
واژه کالوس^[۱۵۸] عبارت است از توده‏ای از سلول‏های تمایز نیافته^[۱۵۹] که از بافت ریزنمونه‏های گیاهی تولید شده است و معمولا بی شکل^[۱۶۰] است (دانشور، ۱۳۹۲). کشت کالوس نخست در اواخر سال های ۱۹۲۰ و اوائل ۱۹۳۰ میلادی گسترش یافت و برای سال‏های بسیاری، یکی از روش‏های اولیه کشت بافت بود. کشت کالوس به میزان گسترده ای در پژوهش های زیست شیمیایی، فیزیولوژیکی و ژنتیکی به کار گرفته می شود (تورس، ۱۹۹۴). از تمام اندام ها و بافت های گیاهی می توان به عنوان ماده اولیه برای تشکیل کالوس استفاده کرد و این نکته را باید در نظر داشت که نوع ماده اولیه (جوان یا بالغ) و موقعیت اندام روی گیاه ( که نشان دهنده میزان هورمون های داخلی است) می تواند اثر مهمی در فرآیندهایی نظیر تقسیم سلولی و تشکیل اندام داشته باشد (رینرت و بجاج^[۱۶۱]، ۱۹۷۷). تنظیم کننده های رشد (اکسین و سیتوکینین) با تحریک تقسیم سلولی و طویل شدن سلول، تشکیل و تکثیر کالوس را در شرایط درون شیشه ای تسریع می کنند (موراشیگ^[۱۶۲]، ۱۹۷۴). می توان برای القای کالوس از هورمون های ۲,۴-D و NAA استفاده نمود (دانشور، ۱۹۹۲). علاوه بر هورمون ها، عوامل فیزیکی هم در تشکیل کالوس میتوانند تاثیر گذار باشند (رینرت و بجاج، ۱۹۹۷). در تشکیل کالوس معمولا دمای ۲±۲۵+ درجه سانتیگراد مفید می باشد. تاریکی و نور نیز می تواند در تشکیل کالوس نقش داشته باشد. بافت های کالوس تشکیل شده از گونه های مختلف گیاهان از نظر شاختمان و نوع رشد باهم متفاوتند. ممکن است رنگ کالوس سفید، زرد کم رنگ، زرد پر رنگ و گاهی قرمز باشد و همچنین بافت آن ممکن است سخت و محکم و یا نرم و آبکی باشد (رازدان، ۲۰۰۳). در یک بررسی رازدان و همکاران (۱۹۸۰) با کشت پروتوپلاست گیاه نخود شیرین در شرایط درون شیشه‏ای در محیط کشت MS همراه با ۲ میلی گرم در لیتر NAA و ۵/۰ میلی گرم در لیتر BAP برای اولین بار موفق به تشکیل کالوس شد. پارامجیت و ماهشواری^[۱۶۳] (۱۹۸۰) گزارش دادند که با قرار دادن ریزنمونه های مریستم شاخه گیاه L.sativus در محیط کشت BM حاوی ۲ میلی گرم در لیتر NAA + 5/0 میلی گرم در لیتر BAP کالوس تشکیل شد. پیووارجیک و پیندل^[۱۶۴] (۲۰۱۴) از ریشه گیاه L.sativus ریزنمونه هایی به اندازه ۲ تا ۳ میلی متر تهیه کردند و در محیط کشت MS حاوی ۲ میلی گرم در لیتر NAA + 2 میلی گرم در لیتر ۲,۴-D + 2 میلی گرم در لیتر کینتین به همراه ۵/۰ گرم در لیتر زغال فعال^[۱۶۵] کشت کردند که منجر به تشکیل کالوس شد. سوآپان و همکاران^[۱۶۶] (۲۰۱۴) تشکیل کالوس را در محیط های کشت MS، B5، LS^[167]، BM^[168] و W^[169] حاوی غلظت های مختلف اکسین‏ها و سیتوکینین‏های مختلف با بهره گرفتن از ریزنمونه میان گره گیاه L.sativus بررسی کردند. آنها گزارش دادند که بهترین محیط کشت برای تولید کالوس در این گیاه، محیط کشت B5 و سپس BM بود. ۲,۴-D نیز در تشکیل کالوس موثر تر از NAA بود. بیشترین کالوس در تیمار محیط کشت B5 حاوی ۲ میلی گرم در لیتر ۲,۴-D + 5/0 میلی گرم در لیتر BAP بود و پس از آن تیمار محیط کشت B5 با ۲ میلی گرم در لیتر NAA + 5/0 میلی گرم BAP موثر بود.
اوچات و همکاران (۲۰۰۱) پروتوپلاسم برگ را وادار به تقسیم کردند و سپس آنها را با پروتوپلاست نخود ترکیب کردند و در تولید کالوس بکار گرفتند. آنها تعداد زیادی از پروتوپلاست های زنده نخود و نخود علوفه ای را که از برگ تهیه شده بودند و بوسیله امتزاج الکتریکی و امتزاج شیمیایی ترکیب شده بودند بدست آوردند. از این روش کالوس زیادی بدست آمد ولی باززایی انجام نشد.
۴-۵-۸-۲ باززائی از کالوس
بعد از تهیه کالوس، در محیط کشت پایه MS همراه با تنظیم کننده های رشد در جهت اندام زائی استفاده می شوند. سینها و همکاران^[۱۷۰] با کشت ریزنمونه های تهیه شده از ساقه ۶ رقم از Lathyrus sativus موفق به تولید کالوس شدند و سپس فقط در یک رقم توانستند در محیط کشت MS با استفاده ازM ^۸-۱۰ پیکلورام و M ^۶-۱۰ بنزیل آمینو پورین جوانه شاخه تولید کنند. همچنین آنها گزارش دادند که برای تولید جوانه شاخه، آدنین سولفات نیز به محیط کشت اضافه شد. روی و همکاران^[۱۷۱] (۱۹۹۲) در یک بررسی ریزنمونه ریشه گیاه L.sativus را در محیط کشت پایه MS حاوی غلظت های مختلف اکسین و سیتوکینین های مختلف کشت کرده که در تیمار ۷/۱۰ میکرو مولار NAA + 9/0 میکرو مولار کینتین بیشترین وزن کالوس بدست آمد و سپس به منظور باززائی شاخه از کالوس، غلظت کینتین را افزایش دادند و کالوس تشکیل شده را پس از گذشت ۱۴ روز، به محیط کشت MS حاوی ۷/۱۰ میکرو مولار NAA + 4/1 میکرو مولار کینتین انتقال دادند و پس از گذشت ۱۸ روز دوباره غلظت کینتین را افزایش داده و کالوس ها را به محیط کشت MS حاوی ۷/۱۰ میکرو مولار NAA + 9/1 میکرو مولار کینیتین انتقال دادند و موفق به تولید شاخه از کالوس شدند. زامبر و همکاران^[۱۷۲] (۲۰۰۲) با کشت ریز نمونه های برگ و ساقه گونه L.sativus در محیط کشت BM حاوی ۱ میلی گرم در لیتر NAA + 5/0 میلی گرم در لیتر TDZ موفق به تشکیل کالوس سبز گره دار با مقداری کالوس زرد رنگ در اطراف آن شدند. آنها با انتقال این کالوس به محیط کشت BM با ۵/۰ میلی گرم در لیتر BAP + 25/0 میلی گرم در لیتر IAA شاخه تولید کردند. بایناد و همکاران^[۱۷۳] (۲۰۱۴) اثر اتیل متان سولفونیت(EMS^[174]) روی رشد کالوس و باززایی از کالوس را در گیاه L.sativus بررسی کردند و گزارش دادند که با کشت ریزنمونه‏های برگ نخود علفی در محیط کشت پایه B5 حاوی ۲ میلی گرم در لیتر NAA + 5/0 میلی گرم در لیتر BAP کالوس تشکیل شد. سپس کالوس ها را با EMS در ۶ غلظت مختلف به مدت ۳۰ و ۶۰ دقیقه تیمار کرده و زیرکشت کردند و مشاهده کردند که EMS مانع رشد کالوس و همچنین باززایی شد، به طوری که رشد کالوس فقط در تیمارهای شاهد، ۱/۰ و ۲/۰ درصد EMS در مدت ۳۰ و ۶۰ دقیقه به رشد خود ادامه داد و باززایی شاخه فقط در تیمارهای شاهد و ۱/۰ درصد EMS در مدت ۳۰ و ۶۰ دقیقه انجام شد. در تیمار شاهد باززایی شاخه در مدت زمان ۲۴ روز و در تیمار ۱/۰ درصد EMS، ۳۲ روز انجام شد.
۵-۵-۸-۲ ریشه زایی
تولید ریشه و سازگار کردن اندام ها به شرایط خارج از محیط کشت در میزان بقاء اندام ها و گیاهچه های تولیدی و تبدیل آنها از حالت هتروتروف به اوتوتروف تاثیر بسزایی دارد. به منظور ریشه دار کردن اندام های ریشه دار شده، آنها را به محیط‏های کشت ریشه زایی منتقل کرده و بعد از تولید ریشه و سازگاری، به خاک منتقل می شوند (تورس، ۱۹۸۹). برای ریشه‏زایی باید میزان قتد محیط کشت زیاد شده و از اکسین ها استفاده شود. البته در برخی موارد حضور اکسین ضروری نمی باشد. بارپت و همکاران^[۱۷۵] (۲۰۱۴) در یک بررسی تاثیر غلظت های مختلف IAA، IBA و NAA را در ریشه زایی شاخساره تولید شده گیاه L.sativus را در شرایط درون شیشه ای گزارش دادند. آنها بیان کردند که در تیمار ۲ میلی گرم در لیتر IAA + 3 درصد ساکارز در محیط کشت MS شاخساره ها به راحتی ریشه دار شدند ولی بیشترین تعداد ریشه (۷۰/۱۳) در تیمار ۲ میلی گرم در لیتر IAA + 5/4 درصد ساکارز در محیط کشت MS مشاهده شد. فراتینی و رویز^[۱۷۶] (۲۰۰۳) گزارش دادند که محیط کشت MS با ۵ میکرو مولار IAA + 1 میکرو مولار کینتین بهترین محیط کشت برای ریشه زایی شاخساره های تولید شده در شرایط کشت بافت گونه های جنس Lathyrus است. همچنین ساکارز ۳ درصد در ریشه زایی بسیار موثر تر از ساکارز ۵/۱ درصد بود. کندیر و همکاران (۲۰۰۹) ریشه زایی شاخساره تولید شده در شرایط کشت درون شیشه‏ای گیاه L.sativus را در محیط کشت MS با غلظت های ۳/۰، ۶/۰، ۹/۰ و ۲/۱ میلی گرم در لیتر NAA بررسی کردند و گزارش دادند که غلظت ۹/۰ میلی گرم در لیتر NAA بهترین تیمار برای تولید ریشه در مدت زمان ۳ هفته بود. بایناد و همکاران (۲۰۱۴) گزارش دادند که با قرار دادن شاخساره تولید شده در شرایط کشت بافت از گیاه L.sativus در محیط کشت ½ MS حاوی ۰۱/۰ میلی گرم در لیتر IBA پس از گذشت ۳ هفته ریشه تشکیل شد. اوچات و همکاران (۲۰۱۰) در یک بررسی گزارش دادند که برای تولید ریشه از شاخساره گیاه L.odoratus بهتر است شاخه ها به صورت جداگانه در محیط کشت ½ MS حاوی ۵/۰ تا ۱ میلی گرم در لیتر NAA ( بر اساس نوع ژنوتیپ) به مدت ۳ هفته نگهداری شوند. همچنین گزارش دادند که اگر ریشه زایی پس از گذشت ۳ هفته شروع شد و هنوز ریشه ها به اندازه کافی بزرگ نشده بودند ( حداقل ۲ سانتیمتر طول و منشعب) باید ۳ هفته در محیط کشت ½ MS بدون هورمون نگهداری شوند تا ریشه ها طویل تر شوند. ساگلام (۲۰۱۲) در بررسی تکثیر درون شیشه‏ای گیاه L.ochrus گزارش داد که با تیمار شاخه های تولید شده در محلول ۵۰ میلی گرم در لیتر IBA به مدت ۵ دقیقه و سپس کشت در محیط کشت MS با ۸ گرم بر لیتر ژل ایزوبگل^[۱۷۷]، پس از گذشت ۵ تا ۷ روز حدود ۶۰ درصد شاخه ها ریشه دار شدند. دمیربگ-ساهین و همکاران^[۱۷۸] (۲۰۰۸) گزارش دادند که با تیمار شاخساره تولید شده در شرایط کشت بافت گیاه L.cicera در محلول ۵۰ میلی گرم در لیتر IBA به مدت ۷ دقیقه و سپس کشت در محیط کشت ½ MS ریشه زایی به راحتی انجام شد.
۶-۵-۸-۲ سازگاری^[۱۷۹]
مرحله سازگاری برای گیاه حاصل از کشت بافت بسیار حائز اهمیت می باشد. گیاه در شراط کشت بافت در یک محیط ژله‏ای فشرده بدون جریان هوا با رطوبت بالا و شدت نور کمتر از محیط طبیعی قرار دارد. همچنین برگ های این گیاهان عادی نیستند و روزنه های بی شکل و واکس های اپیکوتیلی^[۱۸۰] که آنها را مستعد به از دست دادن رطوبت و خشک شدن می کند. بنابراین به دلیل غلظت بالای قند در محیط کشت دارای برگ های نازک و نرمی هستند و نمی توانند به طور موثر فتوسنتز کنند به طوریکه فضاهای خالی در مزوفیل برگ بزرگ تر بوده و روزنه ها دائم باز هستند و همچنین خطر آلودگی های قارچی و باکتریایی نیز وجود دارد (لویولا-وارگاس و وازکوز-فلوتا^[۱۸۱]، ۲۰۰۶). در گیاهان کشت بافتی هنوز هدایت هیدرولیکی آب بین ریشه و ساقه به خوبی برقرار نشده است (فیلا و همکاران^[۱۸۲]، ۱۹۹۸). بنابراین لازم است قبل از انتقال گیاهان تولید شده در شرایط کشت بافت، باید چند هفته سازگاری با کاهش رطوبت تدریجی محیط را طی کنند (کادلچک و همکاران^[۱۸۳]، ۱۹۸۸ و بولار و همکاران^[۱۸۴]، ۱۹۸۸). به منظور سازگاری می توان رطوبت نسبی را در شرایط درون شیشه ای کاهش داد. روش دیگر برای ایجاد سازگاری در محیط آزمایشگاه، باز کردن درب ظروف کشت و قرار دادن آنها به مدت چند روز در یک محیط استریل، به منظور عادت دادن به شرایط طبیعی است (اثنی عشری و زکائی خسروشاهی، ۱۳۸۸). اوچات و همکاران (۲۰۱۰) به منظور سازگار کردن گیاهان L.odoratus تولید شده در شرایط کشت بافت با محیط بیرون، ابتدا گیاهان را از اتاق رشد خارج کرده و به مدت ۲۴ ساعت روی سکوی آزمایشگاه در دمای اتاق و نور معمولی قرار دادند. سپس گیاهان را از لوله آزمایش خارج کرده و ریشه آنها با آب لوله شست و شو داده شد تا آگار از روی ریشه پاک شود تا ابتلا به بیماری های قارچی کمتر شود. سپس گیاهان را در گلدان های حاوی پرلایت و خاک (۱:۱) و یا کمپوست استاندارد کاشتند و در یک محیط گلخانه کوچک نگهداری کردند تا کم کم با شرایط بیرون سازگار شود. بعد از آن گیاهان به گلخانه اصلی منتقل شد که دمای آنجا حدود ۲۵ درجه سانتیگراد و نور طبیعی بود و به مدت ۱ هفته در این شرایط نگهداری شدند. پس از گذشت ۱۰ روز، زمان سازگاری به طور کامل طی شده و گیاهان را می توان به گلدان بزرگ تر منتقل کرد و در گلخانه و یا اگر شرایط محیطی اجازه بدهد در محیط بیرون نگهداری کرد. ساگلام (۲۰۱۲) به منظور سازگار کردن گیاهک های تولید شده L.ochrus در شرایط کشت بافت، پس از شست و شوی ریشه گیاهک با آب مقطر، آنها را به گلدان های حاوی ورمیکولایت^[۱۸۵]، مواد آلی و ماسه (۱:۲:۱) انتقال داد و با بهره گرفتن از کیسه پلاستیکی روی گیاهان پوشش ایجاد کرد و پس از گذشت ۱ هفته به محیط بیرون انتقال داد. دمیربگ و همکاران (۲۰۰۸) نیز به منظور سازگاری گیاهک های تولید شده L.cicera در شرایط کشت بافت، گیاهک ها را در شرایط گلخانه با دمای ۲۴ درجه سانتیگراد و نور طبیعی انتقال دادند.
فصل سوم
مواد و روش ها
فصل سوم
مواد و روش ها
۱-۳ زمان و محل انجام آزمایش
این پژوهش در سال ۱۳۹۳ در آزمایشگاه کشت بافت گروه باغبانی دانشگاه کشاورزی و منابع طبیعی رامین، واقع در شهر ملاثانی (۳۰ کیلومتری شمال شرقی اهواز) انجام شد.
۳-۲ تجهیزات آزمایشگاهی
۱-۲-۳ آزمایشگاه تهیه ترکیبات مختلف، محلول های پایه^[۱۸۶] و محیط های کشت^[۱۸۷]
در این قسمت از آزمایشگاه سه کار عمده انجام می شود:
الف- تهیه ترکیبات و مواد مورد نیاز، تهیه استوک ماکرو و میکرو المنت ها و ویتامین ها و نگهداری آنها در شیشه های تیره در سردخانه در دمای ۱±۴+ درجه سانتیگراد و همچنین تهیه استوک هورمون های مورد نیاز جهت تهیه محیط کشت و نگهداری آنها در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد.
ب- تهیه محیط کشت و سترون کردن آن با بهره گرفتن از دستگاه اتوکلاو. محیط های تهیه شده را می توان همان روز استفاده کرد و یا به مدت حداکثر ۴ هفته در سردخانه در دمای ۱±۴+ نگهداری کرد (دانشور، ۱۹۹۲).
ج- نگهداری شیشه های کشت، شست و شوی شیشه های آلوده بعد از اتوکلاو شدن آنها و از بین بردن عوامل آلودگی.
ابزار و وسایل مورد نیاز جهت تهیه و نگهداری محیط کشت شامل:
- ارلن یک لیتری
- استوانه مدرج یک لیتری جهت به حجم رساندن محیط کشت
- قاشقک^[۱۸۸] جهت برداشتن مواد
- همزن مغناطیسی و مگنت جهت به همزدن ترکیبات محیط کشت^[۱۸۹]
- پیپت در حجم های مختلف جهت تهیه محیط کشت
- ترازوهای دیجیتال با حساسیت بالا (۰۱/۰، ۰۰۱/۰، ۰۰۰۱/۰) جهت توزین مواد مختلف از جمله ساکارز، آگار (با دقت ۰۱/۰)، مواد شیمیایی، ویتامین ها (با دقت ۰۰۱/۰) و هورمون ها (با دقت ۰۰۰۱/۰).
- بشر یک لیتری
- دستگاه پی اچ متر جهت تنظیم pH محیط های کشت با بهره گرفتن از هیدروکسید پتاسیم و اسید کلریدریک ۱ و ۱/۰ نرمال.
- آلومینیوم فویل جهت پیچیدن وسایل در آن و استریل کردن آن‏ها و همچنین بستن درب ارلن حاوی محیط کشت و آگار.
۲-۲-۳ اتاق انتقال^[۱۹۰]
اگرچه آماده سازی و تهیه ریز نمونه، قطعات کالوس و غیره در یک ظرف شیشه ای و یا در بین فیلتر کاغذی استریل انجام می شود، ولی انجام این کار در اتاقک استریل ضرورت دارد. هنگاﻣﻲ ﻛﻪ اﻋﻤﺎل ﻓﻮق در یک ﻓﻀﺎی ﻏﻴﺮاﺳﺘﺮﻳﻞ اﻧﺠﺎم ﺷﻮد ﻣﻴﺰان آﻟﻮدﮔﻲ اﻓﺰاﻳﺶ ﭼﺸﻤﮕﻴﺮی ﻣﻲ ﻳﺎﺑﺪ، ﺣﺘﻲ اﮔﺮ از ﻛﺎﻏﺬ اﺳﺘﺮﻳﻞ ﺟﻬﺖ ﻛﺎر اﺳﺘﻔﺎده ﺷﻮد. محیط اتاق انتقال باید عاری از میکروارگانیسم های بیماری زا باشد و استفاده از اتاقک دارای جریان هوای استریل^[۱۹۱] ضروری می باشد که هوای پالایش شده در آن جریان دارد. با عبور هوا از فیلتر مخصوص به نام HEPA^[192] که اندازه منافذ آن ۲۲/۰ میکرومتر می باشد هوا کاملا گندزدایی می گردد. در سقف این اتاقک از لامپ های فرابنفش میکروب کش^[۱۹۳] برای از بین بردن میکروارگانیسم ها و هواکش با فشار مثبت نصب شده است. معمولا نیم ساعت قبل از شروع کار، دستگاه جریان هوا همراه لامپ فرابنفش و همچنین لامپ های فرابنفشی که در اتاق انتقال نصب شده اند روشن می شود و تمام اتاق انتقال گندزدایی می گردد. قبل از کار، محوطه درونی اتاقک با الکل اتیلیک ۷۰ درصد ضد عفونی شده و با دستمال کاغذی، الکل اتیلیک پاشیده شده خشک می شود.
۳-۲-۳ اتاق رشد^[۱۹۴]
در اتاق رشد کلیه شرایط محیطی از جمله دما، رطوبت، جریان هوا و کیفیت و طول مدت نور به خوبی کنترل می شود. اکثر کشت ها در این اتاق در دمای ۲±۲۵ درجه سانتیگراد تحت فتوپریود ۱۶ ساعت روشنایی و ۸ ساعت تاریکی نگه داری می شوند. میزان شدت نور بسته به گونه گیاهی، نوع ریزنمونه و هدف آزمایش متغییر می باشد. محدوده نوری می تواند بین ۴۰۰ تا ۲۰۰۰ لوکس^[۱۹۵] در نظر گرفته شود. در ظروف در بسته تبادل گازی کم است بنابراین به صورت عادی CO₂ کم و اتیلن زیاد است. با کاهش غلظت CO₂ میزان فتوسنتز در گیاهچه های کشت شده در درون شیشه محدود می شود. چون در شرایط کشت درون شیشه‏ای نور کم و در نتیجه فتوسنتز پایین است، نیازی به افزودن CO₂ وجود ندارد و معمولا بیشتر نیاز گیاه به هیدرات کربن از طریق افزودن ساکارز تامین می شود.
۳-۳ تهیه مواد گیاهی
بذور نخود شیرین مورد استفاده در این بررسی از شرکت نوین سبز پرور در تهران تهیه شد. وسپس در سردخانه در دمای ۱±۴+ درجه سانتیگراد نگهداری و در صورت نیاز مورد استفاده قرار گرفتند.
۴-۳ ریز نمونه های^[۱۹۶] مورد استفاده
در این تحقیق از ریزنمونه‏های میان گره ساقه و برگ جهت اندام زایی غیر مستقیم^[۱۹۷] و مستقیم^[۱۹۸] استفاده شد و جهت پرآوری از جوانه‏های انتهایی و جانبی ساقه استفاده شد. ابتدا بذور نخود شیرین گندزدایی و در محیط کشت MSیک پنجم قدرت برای تولید دانهال در شرایط استریل کشت شد. پس از جوانه زنی بذور و رشد دانهال به مدت ۲ هفته، ریز نمونه های مورد نظر از دانهال تهیه شد.
۵-۳ تهیه محیط کشت
۱-۵-۳ تهیه محلول‏های پایه و نگهداری آنها
در این تحقیق از محیط کشت های MS و B5 استفاده شد. ترکیبات تشکیل دهنده این محیط کشت در جدول ۱-۳ آورده شده است. برای آماده سازی محیط کشت ابتدا محلول‏های پایه عناصر ماکرو، میکرو، ویتامین ها و اسیدهای آمینه به طریق زیر آماده گردید. ابتدا مقدار خاصی از هر کدام از عناصر ماکرو، میکرو، ویتامین ها و اسیدهای آمینه بر اساس دستورالعمل محیط کشت مورد نظر(جدول ۱-۳ و جدول ۲-۳) با ترازوی دیجیتالی وزن گردید. سپس هر کدام از ترکیبات فوق به صورت جداگانه به بشر حاوی ۵۰۰ میلی لیتر آب مقطر اضافه و با همزن مغناطیسی حل گردید. سپس با آب مقطر به حجم ۱۰۰۰ میلی لیتر رسانده و در ظروف تیره درب دار در سردخانه با دمای ۱±۴ درجه سانتیگراد نگهداری شدند.