CD: Circular dichroism.
CDNN: Context dependent neural networks.
DLS: Dynamic light scattering.
DMF: Dimethylformamide.
DMSO: Dimethyl Sulfoxide.
DTT: Dithiothreitol.
MTT: 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide.
RH: Hydrodynamic radius.
RPMI: Rapid Prototyping & Manufacturing Institute.
SDS: Sodium dodecyl sulfate.
ThT: Thioflavin T.
فصل اول
مقدمه
۱-۱- هورمون انسولین
مسیر پیچیده کشف انسولین که با یک مشاهده اتفاقی شروع شد، بیانگر موهبتی بزرگ و آزمایش های دقیق است که به وسیله آن بسیاری از هورمونها کشف شدند. نقطه آغاز ماجرا اصلا ارتباطی با انسولین نداشت. در سال ۱۹۸۹ اسکار مینکوفسکی[۱] به همراه ژوزف فون مرینگ[۲] به بررسی دخالت پانکراس سگ در هضم چربی پرداختند. قبل از انجام آزمایش های مربوط به هضم چربی، مینکوفسکی مشاهده کرد که میزان ادرار سگ به طور قابل توجهی افزایش پیدا کرده است و همچنین مقادیر بالایی از گلوکز در ادرار مشاهده می شود. آنها با این مشاهده به نقش کمبود عاملی از پانکراس در ایجاد دیابت پی بردند. مینکوفسکی تلاش های زیادی در تهیه عصاره ای از پانکراس کرد تا بتواند اثر دیابت را معکوس نماید ولی هیچ وقت به چنین موفقیتی دست نیافت. امروزه با پیشرفت علم مشخص شده که ماهیت پروتئینی انسولین از یک سو و تولید پروتئازها در پانکراس از سویی دیگر، از طریق تجزیه این هورمون به وسیله این آنزیم ها عامل این شکست بوده است.
تلاش های بی ثمر زیادی در این راستا انجام شد که تا تابستان ۱۹۲۱ نتیجه ای در بر نداشت. در این سال دانشمندی به نام فریدریک بنتینگ[۳] با همکاری چارلز بست[۴] در آزمایشگاه مک لود[۵] این موضوع را بررسی کردند. از این به بعد بود که سلول های جزایر لانگرهانس به عنوان محل اختصاصی تولید عامل ضد دیابت مشخص شد. بر همین اساس نام انسولین به دلیل اینکه در جزایر لانگرهانس تولید می شود بر روی عامل ضد دیابت گذاشته شد. بنتینگ و بست به همراه بیوشیمی دانی به نام کولیپ[۶] موفق به تهیه عصاره ی خالصی از پانکراس شدند که سبب بهبود علایم ناشی از دیابت در سگ شد. یک سال بعد با تزریق فرآورده انسولین به پسر بچه ۱۴ ساله ای به نام لئونارد تامپسون که مبتلا به دیابت قندی شدید بود، جان وی نجات یافت. در سال ۱۹۲۳ جایزه نوبل برای این کشف به بنتینگ و مک لود اهدا شد. تا سال های مدید برای تولید انسولین از پانکراس خوک استفاده می شد تا اینکه در دهه ۱۹۸۰ و با پیشرفت مهندسی ژنتیک از ژن های کلون شده انسانی در میکرو ارگانیسم ها برای این منظور استفاده شد.
انسولین هورمونی است که برای تنظیم ذخیره ی انرژی و سوخت و ساز گلوکز در بدن ضروری است و درون بافت های کبدی، ماهیچه ای و چربی به عنوان یک عامل محرک برای دریافت گلوکز از خون و ذخیره ی آن به صورت گلیکوژن عمل می نماید.
انسولین یکی از کوچکترین پروتئین هایی است که دارای ساختار های متنوع پروتئینی شامل مارپیچ آلفا[۷]، صفحات بتا[۸]، چرخش بتا[۹]، خودتجمعی[۱۰] و فیبرهای آمیلوئیدی[۱۱] است (Hua و همکاران ۲۰۰۴، Dobson 1999 ).
۱-۱- ۱- ساختار هورمون انسولین
۱-۱-۱-۱- ساختار اول انسولین
انسولین که اولین هورمون پپتیدی کشف شده می باشد دارای ۵۱ اسید آمینه در دو زنجیره ی پلی پپتیدیA و B است. ساختار طبیعی این هورمون به وسیله سه پلی دی سولفیدی پایدار می شود. در این پروتئین یک پیوند دی سولفیدی درون زنجیره ای بین اسید آمینه ی سیستئین ۶ و ۱۱ زنجیره ی A ، دو پیوند دی سولفیدی بین زنجیره ای میان اسید آمینه های سیستئین موقعیت ۷ زنجیره A و موقعیت ۷ زنجیره ی B، همچنین سیستئین جایگاه ۲۰ از زنجیره A و سیستئین جایگاه ۱۹ زنجیره ی B تشکیل می شود. (Nielsen و همکاران ۲۰۰۱)
شکل ۱-۱- توالی اسید آمینهی پروتئین انسولین انسانی.
ساختار اول انسولین در بین گونه های انسانی وحیوانی به صورت حفاظت شده است. جایگاه پیوند های دی سولفیدی و تعداد اسید های آمینه در هر زنجیره در اغلب گونه ها ثابت است. در بین گونه های مختلف، انسولین های انسانی، گاوی و خوکی دارای بیشترین شباهت هستند. درمقایسه با انسولین انسانی در گونه ی خوکی درموقعیت ۳۰ زنجیره B اسید آمینه آلانین جایگزین اسید آمینه ترئونین شده است و در انسولین گاوی علاوه بر این تغییر در موقعیت A8 آلانین جانشین ترئونین و در موقعیت A10 والین جایگزین ایزولوسین گردیده است. این تغییرات تاثیری بر روی فعالیت زیستی این هورمون ندارد. دیگر اسید های آمینه که بدون تغییر در بین گونه ها باقی مانده اند مسئول شکل گیری ساختار مولکول بوده و به تا خوردگی صحیح مولکول انسولین کمک می کنند. به عنوان مثل باقی مانده های اسید آمینه ی سیستئین، اسید آمینه های غیر قطبی که هسته آبگریز پروتئین را تشکیل می دهند و سایر باقی مانده های اسید آمینه ای که در تا خوردگی صحیح ساختار سوم این پروتئین نقش ایفا می کنند در پدیده های فوق الذکر اهمیت دارند (Brange و همکاران ۱۹۹۳).
۱-۱-۱-۲- ساختار دوم انسولین
در ساختار دوم پروتئین ها زنجیره های پلی پپتیدی حالت منظم به خود می گیرندو به وسیله پیوند های هیدروژنی بین گروه های آمین و کربوکسیل زنجیره های جانبی پایدار می شود. این موتیف های ساختاری شامل مارپیچ آلفا، زنجیره های بتا، چرخش بتا و لوپ هستند.
انسولین پروتئین کروی غنی از ساختار های ثانویه مارپیچ آلفا است. در این پروتئین سه مارپیچ آلفا A2-A8 , A13-A19 , B9-B19))، دو چرخش بتا (B7-B10 , B20-B23) و یک زنجیره بتا B24-B28)) دیده می شود. سه مارپیچ آلفا بدنه اصلی پروتئین انسولین را تشکیل می دهد. در این میان، مارپیچ آلفا A2-A8 به خوبی دو مارپیچ آلفا دیگرتا نمی خورد (Baker و همکاران ۱۹۹۸).
به طور کلی چهار پخش هسته آبگریز انسولین را تشکیل می دهند: مارپیچ مرکزی زنجیره B، پل دی سولفیدی A20-B19)) مارپیچ آلفا انتهای کربوکسیل زنجیره A A13-A19)) و یک چرخش بتا B20-B23)) (Hua و همکاران ۲۰۰۱).
روش معمول برای مطالعه ساختارهای دوم پروتئین استفاده از دستگاه دو رنگ نمای دورانی[۱۲] در محدوده طول موج ۲۵۰ تا ۱۷۰ نانومتر است. مطالعه ساختاری انسولین با این روش نشان دهنده دو کمینه در طول موج های ۲۰۸ و ۲۲۲ نانومتر است که بیانگر ساختارهای مارپیچ آلفا می باشد. همچنین یک کمینه در طول موج ۲۱۸ نانومتر نشانگر صفحات بتای شرکت کننده در ساختار این پروتئین است.
۱-۱-۱-۳- ساختار سوم انسولین
ساختار سوم در واقع نحوه قرارگیری ساختار های دوم در کنار یکدیگر است. در این ساختار چهار نوع بر همکنش شامل پیوند هیدروژنی، پل نمکی، پیوند دی سولفیدی و برهمکنش های غیر قطبی آب گریز بین زنجیره های جانبی اسید آمینه ها وجود دارد. ساختار سوم بیشتر به وسیله ی پیوند دی سولفیدی پایدار می شود که این پیوند ها بین گروه های تیولی باقی مانده های اسید آمینه سیستئین صورت می گیرد.
قابل ذکر است که سطح بیرونی مولکول انسولین قطبی است درحالی که سطح درونی آن بیشتر غیر قطبی می باشد. در آرایش ساختار سوم انسولین سیستئین های A6 و A11 و زنجیره های جانبی اسید های آمینه جایگاه های ۶A و A16 و اسید های آمینه لوسین B11و B15 درون هسته غیر قطبی قرار می گیرند. همچنین ۲۳ اسید آمینه قطبی این پروتئین در بخش های سطحی و در معرض حلال می باشند(Brange و همکاران ۱۹۹۳).
۱-۱-۱-۴- ساختار چهارم انسولین
در ساختار چهارم پروتئین ها، دو یا بیش از دو زنجیره پلی پپتیدی در کنار یکدیگر قرار می گیرند. شاخه جانبی آمینواسیدی این زنجیره های پلی پپتیدی به وسیله ی برهمکنش های آبگزیر و واندروالس با هم تماس می یابند.
در خصوص پروتئین انسولین به دلیل اینکه پیوندهای دی سولفیدی به جای برهمکنش های آبگزیر پایدارکننده و شکل دهنده ساختمان فضایی آن است، ساختار چهارم را حالات دیمر و هگزامر این پروتئین در نظر می گیرند که در آن مونومرها به دلیل برهمکنش های آبگزیر و هیدروژنی کنار یکدیگر قرار دارند. انسولین تنها درغلظت های پایین به صورت مونومر است ولی در غلظت های بالاتر از ۰۱/۰ میلی مولار (که غلظت به کار رفته در فرمولاسیون های دارویی است) به صورت دیمر دیده می شود. در محدود pH بین ۴ تا ۸ و در حضور یون روی هنگامی که غلظت انسولین بالاتر از ۰۱/۰ میلی مولار باشد سه دیمر انسولینی گرد هم آمده و یک ساختار هگزامری را تشکیل می دهند. در غلظت های بالاتر از ۲ میلی مولار و در pH خنثی، حتی در غیاب یون روی انسولین به صورت هگزامر است. دو مولکول انسولین در یک دیمر به وسیله نیروهای آبگریز و چهار پیوند هیدروژنی (بین اتم های زنجیره اصلی متعلق به باقی مانده های B26-B24) کنار یکدیگر نگاه داشته شده اند. در مونومرهای انسولین این چهار پیوند هیدروژنی یک ساختار صفحه ی بتای موازی ناهمسو بین قطعات انتهای C زنجیره B به وجود می آورند. تجمع دیمر ها در اطراف یون روی باعث پوشیده شدن بخش های غیر قطبی ای می شود که در حالت مونومر در سطح هستند (B17, B18, B14, B1, B2 A13, A14). برهمکنش بین دیمرها در حالت هگزامری به میزان قابل ملاحظه ای سست تر از برهمکنش میان مونومر ها در دیمر است. زنجیره های A، بخش بزرگی از سطح عمدتاً قطبی هگزامر را در بر می گیرند. حالت هگزامر این پروتئین ساختاری تقریبا کروی شکل به قطر ۵۰ آنگستروم و ارتفاع ۳۵ آنگستروم است (Jansen و همکاران ۲۰۰۵ ،Jeffrey و همکاران۱۹۹۶).
شکل ۱-۲- ساختار سوم و چهارم انسولین.(a شکل مونومر (b شکل دایمر (c شکل هگزامر.
۱-۱-۲- سنتز هورمون انسولین
انسولین به طور اختصاصی به وسیله ی سلول های بتای جزایر لانگرهانس پانکراس ساخته می شود. اولین محصول ترجمه ی ژن انسولین، پری پرو انسولین با ۱۱۰ اسیدآمینه ای است و ۲۴ اسیدآمینه آن مربوط به پپتید نشانه می باشد. این پپتید نشانه[۱۳] با ذره ی شناساگر سیگنال[۱۴] در سیتوزول بر همکنش می دهد. در مرحله ی بعد این کمپلکس از طریق گیرنده ی مربوطه وارد شبکه ی آندوپلاسمی می شود. با برش پروتئولیتیکی برروی پری پروانسولین در لومن شبکه ی آندوپلاسمی پرو انسولین تشکیل می شود. سپس در پروانسولین با تشکیل پیوندهای دی سولفیدی تا خوردگی مناسب ایجاد می شود. پروانسولین تا خورده به دستگاه گلژی منتقل می شود تا مراحل بعدی پردازش بر روی آن صورت گیرد. پروانسولین که توسط استینر[۱۵] و همکاران کشف شد با حذف آنزیمی توالی اسید آمینه ای موسوم به پپتید C[16] در جایگاه های دو اسید آمینه بازی (آرژنین- آرژنین و آرژنین- لیزین ) تبدیل به انسولین می شود. در این پردازش آنزیمی موسوم به پروهورمون کانورتاز ۳/۱، پروهورمون کانورتاز ۲ و کربوکسی پپتیداز E دخالت دارند. آنزیم های پروهورمون کانورتاز به صورت اختصاصی برش می دهند. پروهورمون کانورتاز ۳/۱ جایگاه اتصال بین زنجیره ی B و پپتید C را برش می دهد در حالی که پروهورمون کانورتاز۲ مسئول برش ناحیه ی بین زنجیره ی A و پپتید C است. همچنین اسید های آمینه باقی مانده به وسیله ی آنزیم کربوکسی پپتیداز E حذف می شوند. در طی این پردازش سه مولکول آرژنین و یک مولکول لیزین آزاد می گردد (Masahiro و همکاران ۲۰۱۱).
شکل۱-۳- نمایی از مراحل سنتز هورمون انسولین.
۱-۱-۳- ترشح هورمون انسولین
هورمون انسولین در پاسخ به محرک هایی چون گلوکز، آرژنین و سولفونیل اوره از سلول های بتای پانکراس ترشح می شود. البته محرک اصلی برای ترشح این هورمون گلوکز می باشد. گلوکز از طریق پروتئین انتقال دهنده ی غشایی GluT-2 به درون سلول های بتای پانکراس وارد شده و به وسیله ی آنزیم گلوکوکیناز اکسایش می یابد. در محدوده غلظت پایین تر از mg/dl 90 گلوکز باز بودن کانال های پتاسیمی سبب ایجاد پتانسیل منفی در غشای سلول های بتا می شود که در این حالت کانال های ورود کلسیم به درون سلول بسته می باشد.
با افزایش غلظت گلوکز پلاسما، دریافت سوخت وساز گلوکز به وسیله ی سلول های بتا افزایش می یابد که این پدیده موجب دپلاریزاسیون غشا و باز شدن کانال کلسیمی و افزایش غلظت درون سلولی کلسیم می شود. این پدیده در نهایت به اگزوسیتوز گرانول های انسولین منجر می گردد.
از منظر ساختاری کانال های پتاسیمی وابسته به ATP در پانکراس ازدو زیرواحد غیر مرتبط گیرنده سولفونیل اوره و زیرواحد کانال پتاسیم تشکیل شده است.
شکل ۱-۴- نمایی شماتیک از سلول بتای پانکراس و چگونگی ترشح انسولین از این سلول.
۱-۱-۴- اشکال مختلف هورمون انسولین
ساختار بلوری انسولین برای اولین بار در سال ۱۹۲۶ توسط ابِل[۱۷] گزارش شد. ده سال بعد اسکات[۱۸] اهمیت یون روی را در ساختار بلور این پروتئین نشان داد (Scott 1934 ،Milthorpe و همکاران ۱۹۹۷) . انسولین در غلظت های کم به شکل مونومر می باشد و در غلظت های بالاتر و pH خنثی به صورت دیمر است. کمپلکس هگزامری انسولین در غلظت های بالا و در حضور یون روی ایجاد می شود. قابل ذکراست که شکل عملکردی انسولین در جریان خون به صورت مونومر و شکل ذخیره ای آن در سلول های بتای پانکراس به صورت هگزامر با دو یون روی می باشد. نیمه عمر هورمون انسولین در حالت مونومری ۵ تا ۱۰ دقیقه است. از آنجایی که این پروتئین در شکل هگزامری دارای نیمه عمر بالایی است به طور بالقوه می تواند متحمل تغییرات شیمیایی پس از ترجمه مانند قندی شدن غیرآنزیمی و استیلاسیون شود.
۱-۱-۵- عملکرد زیستی هورمون انسولین
انسولین نقش مهمی در تنظیم سوخت وساز مهره داران خصوصا سوخت وساز کربوهیدرات ها دارد. این پروتئین برای ایفای نقش هورمونی اش باید بطور صحیح به گیرنده ی غشایی اش وصل شود. اتصال انسولین به گیرنده غشایی سبب فعال سازی یکسری آنزیم های تیروزین کیناز و ایجاد دو اثر بلندمدت و کوتاه مدت می شود. در کوتاه مدت این هورمون باعث افزایش انتقال قند به درون سلول و افزایش سنتز پروتئین و مهار فرایند های هضم لیپیدی[۱۹] می شود. فعال سازی و غیر فعال سازی یکسری آنزیم ها نظیر گلیکوژن سنتتاز و گلیکوژن فسفوریلاز از آثار کوتاه مدت این هورمون است. در بلندمدت این هورمون سبب فعال سازی آنزیم گلوکوکیناز می شود و همچنین برخی آنزیم های مسیر گلوکونئوژنز را نیز مهار می کند. مطالعات زیادی بر روی جهش یافته های انسولین صورت گرفته است تا مشخص گردد که کدام باقیمانده های اسید آمینه ای در اتصال به گیرنده غشایی این هورمون مهم هستند. سه ناحیه حفاظت شده در ساختار انسولین در اتصال به گیرنده غشایی آن نقش برجسته ای دارند. این سه ناحیه شامل ناحیه ی انتهای N زنجیره ی A ( Gly1، Ile2، Val3، Glu4)، ناحیه ی انتهایی Cزنجیره ی A( Tyr19،Cys20،Asn21) و ناحیه انتهای C زنجیره ی B ( Gly23،Phe24، Phe25،Tyr26) می باشد. کلیه ی این باقیمانده های اسیدآمینه ای در سطح انسولین قرار می گیرند. بنابراین احتمال برهمکنش اینها با گیرندهی انسولین زیاد است. انواع جهش یافته انسولین انسانی که تمایل کمی برای اتصال به گیرنده ی این هورمون از خود نشان می دهند، در ایجاد تحمل گلوکز و هایپر انسولینمیا[۲۰] مهم هستند. در این جهش یافته ها باقیمانده های اسید آمینه ای نواحی حفاظت شده با انواع دیگری جایگزین شده اند (Kwok و همکاران ۱۹۸۳، Pullen و همکاران ۱۹۷۶)
جایگزینی های LeuB25 PheB25 ( انسولین شیکاگو)، SerB24 PheB24 ( انسولین لس آنجلس) و ValA3 LeuA3( انسولین واکایاما)، جهش هایی هستند که در سطح ژنی رخ می دهند و در نتیجه انسولینی ایجاد می شود که فقط ۱ تا ۵ درصد توانایی اتصال به گیرنده غشایی را دارد.-N استیلاسیون انتهای آمینی زنجیره ی A تا حدود ۳۰ درصد اتصال این هورمون به گیرنده اش را کاهش می دهد. این پدیده بیانگر اهمیت بارهای مثبت گروه های آمین آزاد در این ناحیه است. حذف GlyA1 با کاهش ۱۵ درصدی اتصال انسولین به گیرنده اش همراه است. با توجه به این مشاهدات گفته می شود که GlyA1 در اتصال صحیح انسولین به گیرنده این هورمون نقش دارد. این آمینواسید در تشکیل پل نمکی با انتهای کربوکسی زنجیره ی B نقش دارد (Wollmer و همکاران ۱۹۸۷، Nanjo و همکاران ۱۹۸۶، Blundell و همکاران ۱۹۷۲).
اهمیت چهار اسیدآمینه ی انتهای کربوکسی زنجیره ی B( 26-23) در اتصال به گیرنده به وسیله ی انواع جهش یافته انسولینی شامل انسولین های شیکاگو و لس آنجلس مشخص شده است. مطالعات حذفی نشان می دهد که با حذف باقیمانده های اسیدآمینه ای انتهای کربوکسی زنجیره ی B (Tyr26،Thr27،Pro28،Lys29،Ala30) انسولینی موسوم به Despentapeptide (B26-B30) حاصل می شود. انسولین کوتاه شده تنها ۲۰ درصد توانایی اتصال به گیرنده غشایی را دارد(۱۹۹۰ Tager، Riemanو همکاران ۱۹۸۳).
۱-۱-۶- گیرنده هورمون انسولین
فرم در حال بارگذاری ...
