وبلاگ

به دلیل اهمیت بالینی بالا و نیز نیاز گسترده به GCSF در مراقبت های بهداشتی، تلاش های زیادی به منظور تولید مولکولهای مشابه با فرم طبیعی انسانی آن که دارای عملکرد باشند در حال انجام است.
در سالهای گذشته محققین ایرانی سعی در بیان آن در کاهوی تراریخته داشتنه اند چراکه در این سالها گیاهان تراریخته برای تولید انواع داروی نوترکیب و واکسن ها مورد استفاده قرار گرفته اند (مهدی شریفی تبار،۱۳۹۲).

فصل دوم مواد و روش ها
۲-۱ میکروارگانیسم های مورد استفاده
از باکتری E. coli سویه ‘ TOP10F به منظور کلونینگ و تکثیر پلاسمیدها و از مخمر Hansenula polymorpha سویه RB11 به عنوان میزبان بیانی مخمری استفاده شد.
۲-۲ محیط های کشت مورد نیاز
جهت رشد باکتری‌ E. coli از محیط کشت LB جامد یا مایع و جهت رشد مخمر از محیطهای کشت YPD جامد یا مایع، BMMY و BMGY استفاده شد (پیوست ۱).
پس از آماده نمودن محیط¬های کشت میکروبی مورد نیاز، این محیط ها در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ دقیقه در فشار یک اتمسفر اتوکلاو گردیدند. محلول‌های قندی یا محلولهای حساس به اتوکلاو با بهره گرفتن از فیلترهای ۲۲/۰ میکرون استریل شدند.
۲-۳ پلاسمیدهای مورد استفاده
وکتور کلونینگ pGH برای کلون نمودن ژن سنتز شده gcsf توسط شرکت مربوطه مورد استفاده قرار گرفت (شکل ۳-۱). وکتور بیانی مورد نیاز برای سلولهای مخمری به صورت سنتتیک و با درج عناصر ضروری جهت بیان پروتئین های هترولوگ در این سلولها با بهره گرفتن از وکتور کلونینگ pGH به عنوان وکتور اولیه ساخته شده است.
شکل ۳-۱. وکتور کلونینگ pGH
۲-۴ آنزیم ها و کیت‌ها
آنزیم Taq DNA polymerase، آنزیم های محدودالأثر، RNaseA و آنزیم T4 DNA ligase از شرکت Fermentas تهیه شدند.
کیت استخراج محصول PCR یا DNA از ژل آگارز از شرکت Roche تهیه گردید.
۲-۵ آنتی بیوتیکها
آنتی بیوتیک ها (آمپی سیلین، تتراسایکلین و زئوسین) با غلظت مناسب (پیوست ۲) تهیه و در ۲۰- درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
۲-۶ روش های عمومی
۲-۶-۱ الکتروفورز افقی محصول PCR و یا نمونه DNA بر روی ژل آگارز
به منظور بررسی نتایج PCR و یا کیفیت هرنوع مولکول DNA، از ژل آگارز استفاده می شود. به همین جهت ابتدا ژل آگارز با غلظت متناسب با سایز مولکول مورد بررسی تهیه می شود. با توجه به ظرفیت کاست ژل، ابتدا پودر آگارز وزن شده و سپس در حجم مشخصی از بافر TAE (پیوست ۳) با رقت X1 حل می گردد. این مخلوط به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق باقی مانده و سپس مخلوط به مدت ۱ دقیقه جوشانده می شود تا به خوبی حل شده و محلول یکنواختی حاصل شود. پس از کاهش دمای محلول تا حدود °C40، به میزان لازم از محلول رنگی DNA Safety Stain به آن اضافه کرده و به آرامی به درون کاست ژل ریخته شده و شانه روی آن قرار داده می شود. پس از چند دقیقه و پس از بستن کامل ژل، شانه به آرامی و به صورت عمودی از داخل آن خارج ‌شده و ژل به همراه کاست در داخل تانک الکتروفورز افقی حاوی بافر TAE (X1) قرار داده می شود. در ادامه نمونه های DNA همراه با حجم مشخصی از بافر بارگذاری ، با ترتیب مشخص به آرامی به درون چاهک ها ریخته می شود. سپس الکترودهای تانک به منبع تغذیه متصل می شود. پس از گذشت مدت زمان مشخص با توجه به اندازه قطعه، جریان برق قطع گشته و ژل از درون کاست خارج می گردد. ژل را در معرض نور فرابنفش قرار داده و باندها را مشاهده می نماییم.
نکته: در صورتی که قرار است DNA از ژل تخلیص شود، به هیچ‌وجه نمی‌بایست به مدت طولانی در معرض اشعه فرابنفش قرار گیرد زیرا این اشعه طول موج پایینی داشته و قادر است در توالی DNA جهش ایجاد کند.
۲-۶-۲ تخلیص محصول هضم آنزیمی با بهره گرفتن از کیت تخلیص از ژل آگارز
جهت انجام کلونینگ، تخلیص محصول هضمهای آنزیمی فوق با بهره گرفتن از کیت تخلیص از ژل (Roche) و بر اساس پروتوکل موجود در کیت به شرح زیر انجام ‌شد:

1. 1. به ازای هر mg100 ژل آگارز بریده شده ، µl300 بافر ۱ (Binding buffer) به هر تیوب اضافه گردید.

1. 1. تیوب ها به مدت ۳۰-۱۵ ثانیه ورتکس شده و سپس به مدت ۱۰ دقیقه در دمای C°۵۶ گرماگذاری شدند.

1. 1. در این مرحله به ازای هر mg100 ژل اولیه، µl150 ایزوپروپانول به تیوب ها اضافه شده وسپس ورتکس گردیدند.

1. 1. محتویات هر تیوب به یکی از ستون های کیت افزوده شده و این مجموعه را با بالاترین سرعت (rpm13000) به مدت ۳۰-۶۰ ثانیه سانتریفوژ نمودیم.

1. 1. مایع زیرین دور ریخته شده و سپس µl500 بافر شستشو به هر ستون اضافه گردید.

1. 1. پس از سانتریفوژ در بالاترین سرعت به مدت ۱ دقیقه، مایع زیرین دور ریخته شده و در این مرحله µl250 بافر شستشو مجدداً اضافه گردید.

1. 1. پس از سانتریفوژ به مدت ۱ دقیقه (در بالاترین سرعت)، هریک از ستون ها را به تیوب های ۵/۱ میلی لیتری انتقال داده و µl35 آب دیونیزه به فیلتر ستون ها اضافه کرده و پس از انکوباسیون ۵ دقیقه ای در دمای اتاق، هریک از تیوبها را مشابه با مراحل قبلی سانتریفیوژ نمودیم.

۲-۶-۳ واکنش لیگاسیون قطعات تخلیص شده
واکنش لیگاسیون پس از تعیین غلظت وکتور و قطعه الحاقی تخلیص شده از ژل آگارز، بر طبق واکنش مندرج در جداول مربوطه انجام گرفت. در نمونه کنترل منفی، وکتور خطی شده به تنهایی در یک واکنش لیگاسیون وارد گردید. به عبارت دیگر، در این واکنش به جای قطعه DNA، آب دیونیزه به مخلوط واکنش اضافه گردید. تمامی تیوب ها به مدت ۱۶ ساعت (ON) در دمای °C4 گرماگذاری شدند. این دما کمک می‌کند تا تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین انتهاهای چسبنده آسان‌تر و با پایداری بیشتری انجام شود و آنزیم لیگاز نیز زمان کافی برای تشکیل پیوند فسفودی‌استری را خواهد داشت.
۲-۶-۴ تهیه سلول‌ های مستعد ‘E. coli TOP10F به روش تیمار با کلرید کلسیم
باکتری مستعد، سلولی است که توانایی لازم برای وارد نمودن پلاسمید به درون خود را پیدا کرده است.

1. 1. یک کلنی از باکتری مورد نظر به مدت ۳-۲ ساعت در حضور تتراسایکلین در محیط LB مایع و در دمای °C37 بر روی شیکر با سرعت rpm 150 کشت داده شد تا جذب نوری محیط کشت در طول موج nm600 (OD600nm) به ۶/۰-۴/۰ رسید.

1. 1. محیط کشت در شرایط استریل (در کنار شعله) به میکروتیوپ استریل منتقل شده و با سرعت rpm9000 به مدت ۳ دقیقه سانتریفوژ شد.

1. 1. محیط کشت دور ریخته شده و رسوب سلولی در µl720 کلرید سدیم mM100 سرد استریل، حل شده و به مدت ۲۰ دقیقه در یخ گذاشته شد.

1. 1. پس از گذشت این مدت، سوسپانسیون باکتریایی با دور rpm9000 و به مدت ۳ دقیقه سانتریفوژ شده و مراحل ۳ و ۴ تکرار شدند.

1. 1. رسوب باکتریایی حاصل در µl300 محلول کلرید کلسیم حل گردید.

۲-۶-۵ انتقال پلاسمید به سلول های مستعد (ترانسفورماسیون)

1. 1. µl100 از سوسپانسیون سلول های مستعد به تیوپ استریل انتقال داده شد.

1. 1. حجم مشخصی از پلاسمید و یا محصول لیگاسیون به سوسپانسیون باکتریایی اضافه شده و تیوب ها به مدت ۳۰ دقیقه درون یخ قرار داده می شوند.

1. 1. بلافاصله تیوب ها به حمام آبی دمای °C42 منتقل شده و به مدت ۹۰ ثانیه گرماگذاری شدند. پس از اتمام این زمان سریعاً تیوب ها را به ظرف یخ منتقل نمودیم.

1. ml 1 محیط کشت مایع LB به محتویات هر یک از تیوبها اضافه کرده و به مدت ۱ ساعت در °C37 گرماگذاری گردیدند.