وبلاگ

• کنترل بیولوژیک: استفاده از دشمنان طبیعی زنجرک و پارازیت‌‌کننده‌های آن از جمله اقداماتی است که تلاش‌هایی در ارتباط با آن‌ها صورت گرفته است (Frazier, 1953; Huffaker et al., 1954).

• • استفاده از گیاهان تراژن مقاوم: این راهکار جدیدی است که به جهت پیشرفت روش‌های مولکولی حاصل شده است. یکی از راه های تولید گیاهان تراژن مقاوم به ویروس‌های ایجاد کننده BCTV استفاده از دی ان ای های ناقص مداخله کننده defective interfering DNA (DI-DNA) می‌باشد. مدتی بعد از آلودگی گیاه میزبان به ویروس پیچیدگی بوته چغندر‌قند، ویروس تولید DI-DNA می‌کند که می‌توان از وجود آن‌ها در جهت تولید مقاومت در گیاهان استفاده نمود. گزارش شده که گیاهان تراژن حاوی کپی‌های از DI-DNA علائم شدید را دیرتر و به صورت خفیف‌‌تری نشان می‌دهند، علاوه براین تجمع دی.ان.ای BCTV نیز در این گیاهان کاهش می‌یابد (Stenger, 1994b). این مقاومت در نتیجه رقابت DI-DNA در استفاده از ماشین همانندسازی میزبان جهت تکثیر با ژنوم کامل ویروس حاصل می‌شود (Frischmuth and Stanley, 1998).

متاسفانه در اکثر موارد آزمایش‌ها نشان می‌دهد که مقاومت به وجود آمده در اثر DI-DNA به علت وجود اختصاصیت تنوع در میان سویه‌های BCTV در طبیعت قابل اجرا نمی‌باشد (Stenger, (1994b. امروزه محقیقن جهت ایجاد مقاومت بر علیه جمینی ویروس‌ها از جمله ویروس‌های ایجاد کننده بیماری پیچیدگی بوته چغندر‌قند از طریق مهندسی گیاهی رو به روش‌های دیگری آورده‌اند که ایجاد سطح وسیع‌تری از مقاومت را به همراه داشته است. از جمله این روش‌ها می‌توان به ایجاد مقاومت مشتق از بیمارگر از طریق بیان پروتین‌های ویروسی، ایجاد مقاومت براساس خاموش سازی ژن‌های ویروسی، ایجاد مقاومت از طریق بیان عوامل ضد ویروسی مشتق شده از بیمارگر و استفاده از پپتیدهای آپتامری (Peptide optamers) اشاره نمود.
۲-۱۱-مقاومت به ویروس پیچیدگی بوته چغندرقند
تاکنون مطالعات زیادی در مورد مقاومت به ویروس پیچیدگی بوته چغندرقند انجام شده است. این روش کنترل ویروس برای تولید چغندرقند در غرب ایالات متحده بسیار حائز اهمیت است. یک بررسی گلخانه‌ای توسط Wintermantel و Kaffka در سال ۲۰۰۶ برای یافتن فاکتورهای موثر بر میزان بیماری کرلی تاپ انجام شد. در این تحقیق رابطه بین سن گیاه در زمان آلودگی، شدت بیماری، تجمع ویروس و میزان خسارت در رقم‌های جدید و تفاوت این گیاهان از لحاظ مقاومت به ویروس که در سنین دو برگی، چهار برگی و شش برگی بوسیله زنجرک Circulifer tenellus مایه‌زنی شده بودند و به مدت ۶ هفته در گلخانه نگهداری شده بودند مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این تحقیق نشان داد گیاهانی که در مرحله دو برگی آلوده شدند همگی به شدت کوتوله شده و سرعت توسعه بیماری و علائم در آنها بسیار بالا بود و تفاوت زیادی بین ارقام مقاوم و حساس دیده نمی‌شد در حالی که در گیاهانی که در مراحل چهار و شش برگی مایه‌زنی شده بودند تفاوت چشمگیرتری بین ارقام مقاوم و حساس از لحاظ میزان علائم دیده می‌شد و ارقام مقاوم میزان بسیار کمتری از علائم را نشان می‌دادند (Wintermantel and Kaffka, 2006).
Strausbaugh و همکاران تاثیر دو حشره کش تیمار کننده بذر (Poncho beta و Gaucho) و ۴ هیبرید چغندر قند که از لحاظ مقاومت به کرلی تاپ مختلف بودند را نسبت به حساسیت به کرلی تاپ مقایسه کردند. طرح آزمایش در دو مکان در جنوب Idaho در سال ۲۰۰۵ برای بررسی کرلی تاپ انجام شد. کاهش پیچیدگی شدید به واسطه آلودگی طبیعی و هجوم برگ خوارها در هر دو مکان اتفاق افتاد. تیمار با هر دو حشره‌کش باعث کاهش بیماری پیچیدگی در مقایسه با نمونه‌های تیمار نشده شد، اما Poncho Beta باعث کاهش بیشتر علائم نسبت به Gaucho در طی فصل رشد شد. Poncho Beta منجر به افزایش محصول و میزان شکر به دست آمده در همه هیبریدها، مخصوصاً در هیبرید‌های حساستر، شد. با توجه به پارامترهای محصول در مورد هیبریدهای مقاوم Poncho Beta همیشه بهتر از Gaucho نیست. Poncho Beta سطحی از کنترل را ایجاد می‌کند که کاربرد آن را به عنوان یک مکمل مقاومت میزبانی در شرایط Idaho توجیه می‌کند (Strausbaugh et al., 2006).
در بعضی تحقیقات گذشته در زمینه مقاومت ارقام چغندر به بیماری پیچیدگی بوته از مایه‌زنی توسط زنجرک‌های ناقل در مزرعه (آلودگی طبیعی) یا تحت شرایط کنترل شده استفاده شده است. (صالحی و همکاران، ۱۳۸۵). در این مطالعات معلوم نیست زنجرک ها کدام ویروس عامل بیماری پیچیدگی بوته را منتقل کرده‌اند و مشخص نیست حساسیت یا مقاومت مشاهده شده در برابر یکی از ویروس‌های تازه توصیف شده بوده است یا چند ویروس. استفاده از همسانه عفونت زای این ویروس ها که هر یک حاوی یک گونه ویروس و حتی یک استرین است و کاملا اختصاصی است می‌تواند این نقیصه را برطرف کرده و تصویر درست تری از مقاومت یا حساسیت ارقام به ویروس‌های پیچیدگی بوته چغندر‌قند به دست دهد. بر همین اساس مطالعه‌ای در این زمینه توسط فتاحی (۱۳۹۱) برای بررسی مقاومت ارقام چغندرقند در برابر جدایه ایرانی ویروس شدید پیچیدگی بوته چغندر قند انجام شد. در این مطالعه از ۱۸ رقم چغندرقند استفاده شد که به دو طریق مایه‌زنی با همسانه عفونت‌زای BSCTV-IR از طریق آگرواینوکولیشن و همچنین مایه‌زنی گیاهان با زنجرک ناقل BSCTV-IR انجام پذیرفت. ۲۱ و ۳۵ روز بعد از مایه زنی گیاهان شدت علایم بیماری از طریق علائم ظاهری و استخراج دی ان ای و تکثیر آن مورد بررسی قرار گرفتند که در نهایت ارقام هیچده‌گانه در ۳ گروه متحمل شامل ارقام BR1،FIMMA ،HM1990 ،۷۲۳۳ ،H5505 ، حساس شامل ارقام رسول، افشاری، هیبرید بالک شیراز، P.P.8، P.P.22، Dorothea، زرقان، ریزوفورت، IC، Flores، Hilma و Polyrow و خیلی حساس که تنها رقم Brigita بود طبقه بندی شدند. قبل از انجام این مطالعه، در مورد مقاومت ارقام چغندرقند در برابر گونه BCTIV تحقیقی صورت نگرفته است.
فصل سوم
مواد و روش‌ها
۳-۱ کشت و پرورش گیاهان مورد استفاده در این تحقیق
در این تحقیق از ۱۱ رقم مهم گونه زراعی چغندر قند (Beta vulgaris L.) که بطور عمده در سطح استان فارس کشت می‌شوند شامل ارقام Brigita ، Dorothea، Rosier، Isella، Flair، Jolge، ۷۲۳۳، ۰۰۶(تربت)، ۰۰۴، (پارس) ۰۰۵و ۰۰۷ (اکباتان) از مرکز تحقیقات جهاد کشاورزی استان فارس واقع در شهرستان زرقان تهیه شد. بذور این گیاهان در سینی‌های حاوی خاک برگ و شن (به نسبت مساوی) کشت و آبیاری گردیدند. سپس یک گیاهچه در مرحله دو تا سه برگی در هر گلدان که حاوی خاک گلخانه، خاک برگ و شن (به نسبت ۱:۲:۳) بودند، نشاء گردید. به منظور جلوگیری از تاثیر سایر عوامل بیماری‌زا برروی عملکرد ارقام چغندر کاشته شده در این پژوهش لازم بود قبل از کشت تمام خاک و وسایل مورد استفاده ضدعفونی ‌شوند. به همین منظور خاک مورد استفاده در دستگاه اتوکلاو موجود در مرکز تحقیقات ویروس شناسی دانشگاه شیراز ضدعفونی شد و تمامی گلدان‌ها و سینی ها مورد استفاده به مدت ۱۲ ساعت در محلول هیپوکلریت سدیم ۱۰% قرار داده شد و سپس بطور کامل شسته شدند. گلدان‌های کشت شده در گلخانه در دمای ۲۵ تا ۳۵ درجه سانتی گراد نگهداری و مطابق معمول آبیاری و تغذیه شدند. تعداد ۱۵ گیاه از هر رقم در ۱۵ گلدلن جداگانه کشت داده شد.
۳-۲- همسانه‌های عفونت‌زای مورد استفاده
از همسانه‌های عفونت‌زای ویروس ایرانی پیچیدگی بوته چغندر قند (۴ BCTIV pBin20-1.) موجود در مرکز تحقیقات ویروس شناسی گیاهی (عینی و بهجت نیا، منتشر نشده) و ویروس پیچیدگی شدید بوته چغندر‌قند (pBin20-1.7 BSCTV-IR) (عباد زاد صحرائی و همکاران، ۱۳۸۷) در آزمایش‌های ارزیابی مقاومت ارقام مختلف چغندر‌قند و برهمکنش این ویروس در سه رقم چغندرقند استفاده شد.
۳-۳- کشت باکتری حاوی سازه‌های دوپار ناقص ویروس‌ها
در این تحقیق از محلول ذخیره باکتری Agrobacterium tumefaciens سویه C58 (نگهداری شده در شرایط ۷۰- درجه سانتی گراد) که حاوی همسانه عفونت زای BCTIV یا BSCTV- IR بود، استفاده شد. بدین منظور ۵۰ میکرولیتر از محلول ذخیره باکتری به سه میلی لیتر محیط کشت مایع سترون LB حاوی ۵۰ میکروگرم در میلی لیتر آنتی بیوتیک‌های ریفامپسین و کانامایسین اضافه و باکتری در شرایط تاریکی و دمای ۲۸ درجه سانتی گراد در حالت تکان خوردن رشد داده شد. برای تهیه ۱۰۰ میلی لیتر محیط کشت مایع LB یک گرم تریپتون (Tryptone)، ۵/۰ گرم عصاره مخمر (Yeast extract) و ۵/۰ گرم کلرید سدیم در ۱۰۰ میلی گرم آب مقطر حل و بعد از استریل شدن توسط دستگاه اتوکلاو با کاهش دمای آن به حدود ۵۵ درجه سانتیگراد به داخل لوله‌های کشت استریل شده ریخته شد.
۳-۴- تهیه زادمایه باکتری حاوی همسانه عفونت‌زای BCTIV و BSCTV-IR برای مایه‌زنی و ایجاد آلودگی بوته‌های چغندرقند
میزان چگالی نوری (optical density, OD) سوسپانسیون باکتری کشت داده شده مرتباً با دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه گرفته شد. غلظت باکتری کشت شده معادل چگالی نوری ۵/۰ در طول موج ۶۰۰ تنظیم گردید. در این حالت، واحد پرگنه ساز (CFU،colony forming unit ) باکتری cells/ml 107×۰۸/۲ می باشد (فتاحی،۱۳۹۱). سپس از این سوسپانسیون به مقدار ۵۰ میکرولیتر به جوانه‌های جانبی و طوقه هر یک از گیاهان سالم چغندر قند با بهره گرفتن از سرنگ Hamilton تزریق گردید. گلدان های کشت شده در گلخانه در دمای ۲۵ تا ۳۵ درجه سانتی گراد نگهداری و مطابق معمول آبیاری و تغذیه شدند. گیاهان مایه‌زنی شده مرتباٌ از نظر بروز علائم بیماری مورد بازدید قرار گرفته و در زمان های ۲۱ و ۳۵ روز پس از مایه زنی برای تعیین شدت علایم یادداشت برداری صورت گرفت (برای اطلاعات بیشتر به بخش ۳-۱۸ مراجعه شود). پس از ۲۱ روز و ۳۵ روز از زمان مایه‌زنی از گیاهان آلوده استخراج DNA صورت گرفت و با انجام PCR وجود ویروس در آنها مورد بررسی قرار گرفت.
۳-۵- استخراج دی.ان.ای از بافت گیاهی
استخراج دی. ان. ای از بافتهای گیاهی به دو روش، CTAB و استفاده از کیت Genomic DNA isolation kit (Denazist, Iran) انجام شد.
۳-۵-۱- استخراج DNA از بافت های گیاهی با بهره گرفتن از محلول CTAB
مقدار ۲۰۰ میلی گرم بافت برگ را درون لوله های اپندورف ۵/۱ میلی لیتری با بهره گرفتن از ازت مایع کاملاُ خرد و مقدار ۷۰۰ میکرولیتر بافر CTAB 2.5% CTAB, 1.4 M NaCl, 20 mM EDTA pH=8.0) , 100 mM Tris-HCl pH=8, 2% 2-mercaptoetanol) به بافت مورد نظر اضافه گردید و سپس به مدت نیم ساعت در دمای C◦۶۵ قرار داده شد و هر از چند دقیقه لوله­ها به هم زده شدند. بعد از آن ۶۰۰ میکرولیتر محلول کلروفرم- ایزوآمیل الکل (به نسبت ۱:۲۴) به عصاره افزوده شد و پس از ۵ دقیقه تکان دادن، به مدت ۵ دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ گردید.
پس از انتقال ۵۰۰ میکرولیتر لایه رویی به یک لوله جدید، هم حجم آن ایزوپروپانول سرد اضافه شد و سپس محلول به مدت ۸ دقیقه در ۱۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ شد. بعد از حذف ایزوپروپانول، رسوب DNA با ۳۰۰ میکرولیتر اتانول ۷۰ درصد شستشو و مطابق قبل سانتریفوژ شد؛ و سپس در در دستگاه تغلیظ کننده ( (concentrator خشک گردید و در ۶۰ میکرولیتر آب مقطر سترون حل شد ( Gawel and Jarret., 1991).
۳-۵-۲ استخراج DNA از بافت های گیاهی با بهره گرفتن از کیت
مقدار ۲۰۰ میلی گرم بافت برگ از هر نمونه درون لوله های اپندورف ۵/۱ میلی لیتری بطور جداگانه با بهره گرفتن از ازت مایع کاملاُ خرد شد و سپس با بهره گرفتن از (Genomic DNA isolation kit (DENAzist, (Iran طبق دستورالعمل خود شرکت سازنده استخراج دی ان ای صورت گرفت.
۳ – ۶- آزمون زنجیره ای پلیمراز ((PCR
به منظور ردیابی جدایه­ی ایرانی ویروس پیچیدگی شدید بوته­ی چغندرقند (BSCTV-IR ) از یک جفت آغازگری اختصاصی این ویروس (جدول ۳-۱) که یک قطعه­ی ۴۹۶ جفت بازی از ژنوم این ویروس را تکثیر می­ کند و برای ردیابی ویروس ایرانی پیچیدگی بوته­ی چغندرقند (BCTIV) از یک جفت آغازگر اختصاصی این ویروس (جدول ۳-۲) که یک قطعه­ی ۶۸۲ جفت بازی از ژنوم این ویروس را تکثیر می­ کند در واکنش زنجیره ای پلی مرآز استفاده شد. واکنش PCR به دو صورت که شامل استفاده از ترکیبات جدول ۳-۳ و استفاده از مسترمیکس شرکت amplicon بود، انجام شد. واکنش PCR در دستگاه Thermocycler شرکت Eppendorf و یا مدل FTGENE2D شرکت Techne با سیکل دمای ذکر شده در جدول ۳-۴ انجام شد.
محصول PCR با بهره گرفتن از الکتروفورز در ژل آگاروز ۱ درصد در بافر TBE (8/10 گرم تریس، ۵/۵ گرم بوریک اسید و ۷۳/۰ گرم EDTA در ۱۰۰۰ میلی لیتر آب مقطر، ۳/۸pH=) بررسی گردید.
رنگ آمیزی ژل با اتیدیوم بروماید صورت گرفت. با دستگاه UV transilluminator باندهای نوکلئیک اسید مشاهده گردید و به وسیله دستگاه gel documentation از ژل عکسبرداری شد.

جدول ۳-۱ آغازگرهای مورد استفاده برای تکثیر قطعه­ی ۴۹۶ جفت بازی از ژنوم BSCTV-IR

ترادف (۵ʹ ۳ʹ)
جهت
نام آغازگر

GTGGATCAATTTCCAGACAATTATC
Virion-sense strand
BSCTV-IR358^V

CCCCATAAGACCCATATCAAACTTC
Complementary-sense strand
BSCTV-IR853^C

مکان نوکلئوتیدی BSCTV-IR با رس شمار بانک ژن X97203