وبلاگ

شکل ‏۴‑۲۴: درصد نمونه های مثبت برای دو ژن aph(3’)-IIIa و aac(6’)-Ie-aph(2”)-Ia در دو ژن

شکل ‏۴‑۲۵: درصد نمونه هایی که نتایج ژن ant(4’)-Ia در آنها مثبت شده است
شکل ‏۴‑۲۶: درصد نمونه هایی که ژن aph(3’)-IIIa در آنها مثبت است
شکل ۴‑۲۷: نمودار مقایسه نتایج حضور ژن های مقاومت به جنتامایسین در نمونه­های مورد بررسی.
شکل ‏۴‑۲۸: نمودار مقایسه نتایج حضور ژن های مقاومت به استروپتومابسین در نمونه های مورد بررسی
فصل پنجم
بحث و پیشنهادات
بحث
انتروکوک­ها را می­توان به صورت فلور نرمال درمدفوع افراد بالغ یافت. با این حال این باکتری­ ها یک پاتوژن مهم بیمارستانی نیز هستند (۶۰, ۱۷۲) و می توانند عامل شیوع عفونت ادراری، اندوکاردیت و مننژیت شوند.(۱۷۳) در مطالعه حاضر ۱۰۰ نمونه این باکتری­ ها از نمونه­های ادرار، زخم، آسیت، بیوبسی، مایع نخاع، پلور، خلط، مایع مفصل، برنش، پرستات، بیضه، خون، واژن، ترشحات سینوسی، جفت، پریکارد و آبسه بدست آمد.
گفته می­ شود که انتروکوکوس فکالیس با نود درصد بروز، و بعد از آن انتروکوکس فاسیوم با ۱۰ تا ۱۵ درصد بروز، شایع ترین علت در عفونت های انتروکوکی هستند ظهور آنها در دو دهه اخیر به صورت چشمگیری افزایش پیدا کرده است. (۱۷۳, ۱۷۴) مصرف بی رویه آنتی بیوتیک هایی مانند آمینوگلیکوزید ها، سفالوسپورین ها، آزترئونام ها، خانواده بتالاکتام ها، تری متوپریم و … موجب افزایش مقاومت و پیشرفت باکتری شده است(۱۷۵). هرچند که به نظر می رسد انتروکوک ها برای بدست آوردن ژن های مقاومت و انتقال آنها بسیار مستعد هستند(۱۷۶). این دو عامل سبب شده است که امروزه با پدیده HLAR مواجه شویم.
در مطالعه حاضر ۱۶% نمونه ها انتروکوکوس فاسیوم و ۸۴ % انتروکوکوس فکالیس بودند که با میزان بروز در مطالعات دیگران که در بالا اشاره شد برابری می­ کند.
از ۱۶ نمونه مربوط به انتروکوکوس فاسیوم، ۶ مورد مربوط به مردها و ۱۰ مورد در زنان ­شناسایی شده است. همین طور از ۸۴ مورد انتروکوکوس فکالیس ۲۸ مورد از مردان و ۵۶ مورد در زنان شناسایی شده است. رابطه معنی داری میان ارتباط عفونت بین زنان و مردان با در نظر گرفتن آزمون معنی داری آنووا (P value <0.05) دیده می­ شود. زنان بیشتر از مردان به انتروکوکوس آلوده می­گردند.
شکل۴‑۲ جداسازی نمونه­ها به تفکیک محل بدست آمدن نمونه و جنسیت را نشان می‌دهد. در بین نمونه های کلینیکی بیشترین موارد انتروکوکوس از ادرار به تعداد ۵۴ نمونه از زنان و ۱۸ نمونه از مردان جدا گردیدند. کمترین تعداد نمونه مربوط به خلط با مجموع ۷ نمونه می‌باشد. ۴ نمونه مثبت از مردان و ۳ نمونه مثبت از زنان بدست آمد. همین طور ۸ نمونه از زخم و ۱۴ نمونه از بافت بدست آمد. نتایج مربوط به تفکیک جنسیت و نوع نمونه، فقط در مورد نمونه­های ادرار معنی دار بوده و نشان می دهد که زنان از مردان بیشتر به عفونت ناشی از انتروکوک مبتلا می‌شوند (P value <0.05). سایر نمونه هابه دلیل کم بودن تعداد نمونه­ها، اعتبار محاسبه آماری نداشتند.
نتایج مربوط به گروه ­های سنی که در نمودار شکل۴‑۵ مشاهده می کنید. در گروه سنی ۲۵ تا ۴۴ ساله چه در زنان و چه در مردان به صورت معنی داری، عفونت با انتروکوکوس بیشتر مشاهده می شود. به طوری که ۳۸ % نمونه ها به تنهایی مربوط به این گروه سنی می‌باشد. در این گروه سنی از ۳۸% کل گروه ۲۶% را زنان و ۱۲% را مردان تشکیل می­ دهند. این بدین معناست که در گروه ۲۵ تا ۴۴ ساله، ۴۲/۶۵ درصد را زنان و باقی را مردان تشکیل می­ دهند.
همین طور این آمار در مورد انتروکوکوس فکالیس نیز صادق بوده و مشخص شده است که در گروه سنتی ۲۵ تا ۴۴ نیز بیشترین عفونت ناشی ازآلودگی به انتروکوکو فکالیس مشاهده می­گردد.
نتایج مربوط به گروه ­های سنی نمونه­های انتروکوکس فاسیوم را در شکل۴‑۷ مشاهده می­کنید، اطلاعات نشان می‌دهد که گروه ۷۵ سال به بالا در مردان و گروه سنی کودکان، ۲۵ تا ۴۴ و ۷۵ سال به بالا در زنان، مستعد آلودگی به انتروکوک فاسیوم می باشند. معنی دار بودن اطلاعات به دلیل کم بودن تعداد نمونه­ها قابل بررسی نیست.
انتروکوک­ها به صورت ذاتی حساسیت کمی، خصوصاً مقاومت متقاطع به خانواده آنتی بیوتیک­های آمینوگلیکوزیدی را نشان می­ دهند. تصور می شود که این مقاومت ذاتی به دلیل کم بودن میزان جذب آنتی بیوتیک توسط باکتری است (۱۷۷). بنابراین مطابق فرض مطالعه ما، در حساسیت سویه‌های بالینی بدست آمده به آنتی بیوتیک های آمینوگلیکوزیدی، سطح پایینی از مقاومت باید مشاهده می شد. اما انتروکوک­های این مطالعه، توانسته بودند سطح بالایی از مقاومت به آنتی بیوتیک­ها را بدست آورند. در پزوهش ما برای غربالگری نمونه­ها و تشخیص HLAR از روش دیسک دیفیوژن (کربی بائر) با غلظت های بالای جنتامایسین (۱۲۰ میکروگرم) و استرپتومایسین (۳۰۰ میکروگرم) استفاده گردید. این بررسی نشان داد که خلاف تصور عمومی، درصد بالایی، مقاومت افزایش یافته به آمینوگلیکوزید­ها وجود دارد. با این حال این مقاومت افزایشی یه صورت کاملاً مشخص مربوط به نمونه­های بدست آمده از انتروکوکوس فاسیوم بود. البته در بین نمونه های انتروکوکوس فکالیس نیز به وضوح نشان داده شد که در حال گسترش است (۱۷۸).
مقاومت انتروکوک­ها نسبت به آنتی بیوتیک­های مورد استفاده در مطالعه ما به ترتیب تتراسایکلین (۹۵%)، استرپتومایسین (۵۶%)، جنتامایسین (۵۶%)، سیپروفلوکساسین (۵۳%)، پنی سیلین (۲۶%)، آمپی سیلین (۲۳%) و نیترفورانتوئین (۱%) بود. بدین معنا که تمام نمونه ها به یک آنتی بیوتیک خاص مقاومت کامل نشان نداده­اند. در عفونت­های جدی در بیماران دارای نقص و یا سرکوب سیستم ایمنی یک آنتی بیوتیک فعال بر روی دیواره سلولی مانند پنی سیلین و ونکومایسین به همراه آمینوگلیکوزید­هایی مانند جنتامایسین و استرپتومایسین باید استفاده شود. خانواده بتالاکتام­ها با ناپایدار کردن و ایجاد اختلال در دیواره می توانند جذب آمینوگلیکوزید­ها را افزایش داده و یک اثر سینرژیسم در درمان عفونت داشته باشند.
در مواردی که دیسک گذاری یک سویه HLAR را مشخص می­ کند و همین طور استفاده از آنتی بیوتیک­های موثر بر روی دیواره کارایی ندارند، درمان ناموفق خواهد بود. این دلیلی ارزشمند برای تشخیص میزان مقاومت باکتری عامل عفونت قبل از تجویز دارو است. روند رو به گسترش مقاومت نسبت به آمینوگلیکوزید ها باعث شده است که مشکل درمان انتروکوکی در آتی به شدت مشخص و دچار ناکارآمدی شود.
مطالعه ما نشان می­دهد که استفاده از روش دیسک گذاری برای تعیین مقاومت کاملا کاربردی و قابل استفاده نیست و همین طور توصیه می­کنیم که هرچند، کربی بائر روش رایجی است ولی از بررسی به روش­های مولکولی نیز به دلایل مذکور استفاده شود.
از مجموع ۱۰۰ نمونه بدست آمده، تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن که در شکل۴‑۸ آمده است، مشخص شد که ونکومایسین (میکروگرم ۳۰) ، ۹۸/۲% نمونه ها، به سیپروفلاکساسین ، ۹۶/۳% تعداد نمونه ها برای جنتامایسین (میکروگرم۱۲۰) ۶۶/۳۳% نمونه­ها و استرپتومایسین (میکروگرم ۳۰۰) ۶۲/۳۷% مقاوم هستند. ۴۳/۵۶% به سیپروفلاکساسین حساس، ۹۶/۳% حدواسط و ۴۸/۵۲% مقاوم هستند. از تعداد ۱۰۰ نمونه ۹۴/۵% به تتراسایکلین حساس و ۶/۹۴% مقاوم گزارش شدند. ۲۷/۵۳%در مورد پنی سیلین (۱۰ U) حساسیت و ۹۹/۰% حد واسطه و ۸۸/۲۲% مقاوم گزارش شده اند. برای آمپی سیلین (۱۰ میکروگرم) ۷۷/۲۲% حساس و بقیه مقاوم گزارش شده اند. نتیروفورانتوئین با ۴/۹۷% حساسیت بیشترین تاثیر را بر روی نمونه ها داشته است. جنتامایسین (۱۲۰ میکروگرم) با ۱۱ نمونه حساس و ۶۶/۳۳% حد واسط و ۵۵/۴۵% مقاومت یک آنتی بیوتیک در استانه مقاومت گزارش می شود. استرپتومایسین (۳۰۰ میکروگرم) با ۶/۹۳% حساسیت، ۳۷/۶۲% حدواسط و ۵۵/۴۵% مقاومت نیز مشاهده شد. از انتروکوکوس فکالیس ATCC29212 نیز به عنوان کنترل منفی همواره استفاده شد.
در تعیین حساسیت نمونه­های انتروکوکوس فکالیس بدست آمده از بیماران، ۷۵% حساسیت به ونکومایسین، ۴۲% به سیپروفلاکساسین، ۷۲% به پنی سیلین، ۸۲% به نیتروفوروتزین، ۱۱% به جنتامایسین و ۷% به استرپتومایسین حساسیت مشاهده شد. بیشترین درصد مقاومت مربوط به تتراسایکلین با ۸۴% گزارش گردید.
مطابق نتایج بدست آمده شکل۴‑۸ که در جدول ‏۴‑۲ قابل مشاهده است، بیش از نیمی از نمونه ها (۵۶%) به غلظت­های افزایش یافته جنتامایسین و همین طور استرپتومایسین مقاومت کامل نشان دادند. همین طور ۶۶/۳۳ % نمونه ها در برابر آنتی بیوتیک جنتامایسین، در گروه حد واسطه قرار گرفتند. برای استرپتومایسین ۶۲/۳۷ % نمونه­ها گزارش شد. پیش بینی می­ شود که در چند سال آتی، مقاومت افزایشی به گروه خانواده آمینوگلیکوزید ها به شدت افزایش پیدا کرده و مقاومت کاملی به دوزهای بالای این آنتی بیوتیک­ها پیدا گردد
همین طور از ۱۰۰ نمونه بدست آمده، تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی به روش دیسک دیفیوژن که در شکل۴‑۸ آمده است، مشخص گردید که به ونکومایسین (۳۰ میکروگرم) ، ۹۸/۲% نمونه­ها، به سیپروفلاکساسین ، ۹۶/۳% تعداد نمونه­ها برای جنتامایسین (۱۲۰ میکروگرم) ۶۶/۳۳% نمونه­ها و استرپتومایسین (۳۰۰ میکروگرم) ۶۲/۳۷% نمونه ها مقاومت حد­واسط داشتند که فقط با روش های مولکولی، مقاومت به آنتی بیوتیک در آنها مشخص می­ شود. آزمایشگاه های تشخیص طبی، که از روش های واکنش زنجیره ای پلی مراز استفاده نمی‌کنند، نمی ­توانند به طور دقیق مقاومت و یا حساسیت نمونه بالینی خود را به آنتی بیوتیک های فوق خصوصا خانواده آمینوگلیکوزیدی مشخص نمایند.
در نمودار شکل۴‑۱۰ مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین به تفکیک مرد و زن به نمایش در آمده است. به طوری که از کل نمونه های ادرار (۶۶ نفر شامل ۴۴زن و ۲۲مرد) ۳۳ نمونه (۵۰%) مقاوم، ۴ نمونه (۶%)حساس و ۲۹ نمونه (۴۳%) حد واسط شدند. در ۷ نمونه زخم­، ۵ نمونه مقاوم و ۲ نمونه حد واسط بودند. در ۴ نمونه مایع نخاع، ۲ نمونه مقاوم و ۲ نمونه حد واسط بودند. در ۳ نمونه پلور، هر ۳ نمونه مقاوم بودند. در سه نمونه آسیت، هر ۳ نمونه مقاوم بودند. در ۲ نمونه خلط، هر ۲ نمونه مقاوم بودند. در ۲ نمونه مایع مفصلی، هر ۲ نمونه مقاوم بودند. نمونه های BAL، برونش، پروستات، ترشحات سینوس و نمونه واژینال هر یک ۱ نمونه همه حد واسط و نمونه های بیضه، هیپ، خون، پریکارد، آبسه و بیوپسی هریک ۱ نمونه و همه مقاوم و تنها ۱ نمونه جفت حساس بود.
در نمودار شکل۴‑۱۱ مقاومت افزایش یافته به استرپتومایسین به تفکیک مرد و زن به نمایش در آمده است. به طوری که از گل نمونه های ادرار (۶۶ نفر شامل ۴۴زن و ۲۲مرد) ۳۳ نمونه (۵۰%) مقاوم، ۵ نمونه (۵/۷%) حساس و ۲۸ نمونه (۴۲%) حد واسط شدند. در ۷ نمونه زخم ، ۴ نمونه مقاوم و ۳ نمونه حد واسط بودند. در ۴ نمونه مایع نخاع، ۱ نمونه مقاوم و ۳ نمونه حد واسط بودند. در ۳ نمونه پلور، هر ۳ نمونه مقاوم بودند. در سه نمونه آسیت، ۲ نمونه مقاوم و ۱ نمونه حد واسط بود. در ۲ نمونه خلط، هر ۲ نمونه مقاوم بودند. در ۲ نمونه مایع مفصلی، هر ۲ نمونه مقاوم بودند. نمونه های BAL، بیضه، آبسه و نمونه واژینال هر یک ۱ نمونه همه حد واسط و نمونه های برونش، پروستات، هیپ، خون، جفت، پریکارد، ترشحات سینوس و بیوپسی هریک ۱ نمونه و همه مقاوم بودند.
تشخیص زود هنگام مقاومت انتروکوکی و استفاده از راه های درمانی مناسب به از بین بردن عامل عفونت و جلوگیری از روند رو به رشد مقاومت افزایشی خواهد انجامید. هرچند که هم اکنون نیز با بروز پدیده مقاومت چند دارویی بعلاوه مقاومت به ونکومایسین ها و آمینوگلیکوزید ها، پروتکل درمانی مشخصی ارائه نشده است.
در مطالعه حاضر همچنین مواردی وجود داشت ( تقریبا کمتر از ۵ درصد) که نمونه­ها در تست دیسک دیفیوژن میزان حدواسط را نشان دادند در حالی که در آزمون واکنش PCR، ژن مقاومت حضور داشت. حدس زده می­ شود که حضور این ژن­ها به واسطه پلاسمید، عامل اصلی مقاومت نمی ­باشد. بلکه میزان بیان ژن­ها، تحت فاکتورهای متفاوت ( نوع میزبان، تعداد کپی نامبر) عامل اصلی تولید مکانیسم­های مقاومت می­باشد که باید در مطالعات آینده به بررسی میزان بیان ژن ها نیز پرداخته شود.
در مطالعه حاضر نمونه­هایی که از ادرار افراد مبتلا گرفته شده بود، به شدت ژن­های مقاومت را از خود بروز داده­اند. در حالی که بقیه نمونه­هایی که از محل های دیگر بدست آمده بود، دارای مقاومت آنتی بیوتیک نبوده است.
در PCR ژن aac(6’)-Ie-aph(2’’)-Ia از کل نمونه های ادرار ۳۸% ، زخم ۵%، پلور ۳%، آسیت ۳%، خلط، مایع مفصلی، BAL، برونش، پروستات، بیضه، بافت هیپ، خون و نمونه واژینال وسینوس هر یک ۱% مثبت شد و PCR مایع نخاعی منفی گردید.
در PCR ژن ant(4’)-Ia از کل نمونه های ادرار ۱۹% ، زخم ۴%، مایع نخاعی ۳%، پلور، آسیت، خلط ، نمونه واژینال هر یک ۱% PCR مثبت شدند و در مایع مفصلی، BAL، برونش، پروستات، بیضه، بافت هیپ، خون وسینوس PCR منفی گردید
در PCR ژن aph(3’)-IIIa از کل نمونه های ادرار ۳۷% ، زخم ۴%، مایع نخاعی ۱%، پلور۲%، خلط۲%، آسیت، مایع مفصلی، بافت هیپ هر یک ۱% PCR مثبت شدند و در نمونه واژینال، BAL، برونش، پروستات، بیضه، و سینوسPCR منفی گردید.
در مولتی پلکس PCR سه ژن aac(6’)-Ie-aph(2’’)-Ia و ant(4’)-Iaو aph(3’)-IIIa از کل نمونه های ادرار ۶% ، زخم ۲%، پلور۱% PCR مثبت شدند و مایع نخاعی، خلط، آسیت، مایع مفصلی، بافت هیپ و نمونه واژینال، BAL، برونش، پروستات، بیضه وسینوس PCR منفی گردید.
در مولتی پلکسPCR دو ژن aac(6’)-Ie-aph(2’’)-Ia و ant(4’)-Ia از کل نمونه­های ادرار ۹% ، زخم ۳%، پلور۱%و خلط ۱% PCR مثبت شدند و مایع نخاعی، آسیت، مایع مفصلی، بافت هیپ و نمونه واژینال، BAL، برونش، پروستات، بیضه وسینوس PCR منفی گردید.
در مولتی پلکس PCR دو ژن aac(6’)-Ie-aph(2’’)-Ia و aph(3’)-IIIa از کل نمونه­های ادرار ۲۵% ، زخم ۳%، پلور۲% PCR مثبت شدند و آسیت، خلط، مایع مفصلی و پروستات، بافت هیپ و نمونه خون هر یک ۱% مثبت شدند و مایع نخاعی، نمونه واژینال، BAL، برونش، بیضه وسینوس PCR منفی گردید.
پیشنهادات
باتوجه به اینکه میزان مقاومت آنتی­بیوتیکی در سطح بالایی قرار دارد، پیشنهاد می شود میزان حضور ژن­های مقاومت به ونکوومایسین و جنتامایسین و استرپتومایسین با هم مقایسه و معنی دار بودن یا نبودن آن بررسی شود.
همچنین مطالعه ما میزان بیان ژن های مقاومت به آنتی بیوتیک­های موجود را بررسی نکرده است که پیشنهاد می­ شود در ادامه مطالعات، میزان بیان ژن­ها نیز تحت فاکتورهای متفاوت بررسی و معنی دار بودن آنها مشخص شود.
از روش­های مولکولی واکنش زنجیره­ای پلی­مراز برای تشخیص سریع و قطعی مقاومت در کنار روش­های دیسک گزاری استفاده شود. تشخیص درست، سریع و قطعی، تنها راه جلوگیری از افزایش مقاومت به آنتی بیوتیک ها و گسترس پدیده HLAR است.
منابع:
غلامعباس, موسوی سید, قاسمی احمد, و رضوان, منیری. (۱۳۸۸). بررسی مقاومت چند دارویی در سویه های انتروکوکوس فکالیس جدا شده از نمونه های بالینی در بیمارستان شهید بهشتی و زایشگاه شبیه خوانی کاشان در سال مجله میکروب شناسی پزشکی ایران, ۳(۲), ۲۱-۲۶.
Manero A, Blanch AR. Identification of Enterococcus spp. with a biochemical key. Appl Environ Microbiol. 1999;65(10):4425-30.
Arias CA, Murray BE. The rise of the Enterococcus: beyond vancomycin resistance. Nat Rev Microbiol. 2012;10(4):266-78.
Conceicao N, de Oliveira Cda C, da Silva LE, de Souza LR, de Oliveira AG. Ampicillin susceptibility can predict in vitro susceptibility of penicillin-resistant, ampicillin-susceptible Enterococcus faecalis Isolates to amoxicillin but not to imipenem and piperacillin. J Clin Microbiol. 2012;50(11):3729-31.
Diaz L, Kiratisin P, Mendes RE, Panesso D, Singh KV, Arias CA. Transferable plasmid-mediated resistance to linezolid due to cfr in a human clinical isolate of Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 2012;56(7):3917-22.
Seputiene V, Bogdaite A, Ruzauskas M, Suziedeliene E. Antibiotic resistance genes and virulence factors in Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis from diseased farm animals: pigs, cattle and poultry. Pol J Vet Sci. 2012;15(3):431-8.
Djahmi N, Boutet-Dubois A, Nedjai S, Dekhil M, Sotto A, Lavigne JP. Molecular epidemiology of Enterococcus sp. isolated in a university hospital in Algeria. Scand J Infect Dis. 2012;44(9):656-62.
de Regt MJ, van Schaik W, van Luit-Asbroek M, Dekker HA, van Duijkeren E, Koning CJ, et al. Hospital and community ampicillin-resistant Enterococcus faecium are evolutionarily closely linked but have diversified through niche adaptation. PLoS One. 2012;7(2):e30319.
Chouchani C, El Salabi A, Marrakchi R, Ferchichi L, Walsh TR. First report of mefA and msrA/msrB multidrug efflux pumps associated with blaTEM-1 beta-lactamase in Enterococcus faecalis. Int J Infect Dis. 2012;16(2):e104-9.
Lopez M, Alvarez-Martinez MJ, Marco F, Torres C. [Glycopeptide-resistant Enterococcus faecium. Analysis of the resistance genotype, virulence and genetic lines]. Enferm Infecc Microbiol Clin. 2013;31(1):10-4.