وبلاگ

مواد و روش ها
۳-۱- آماده سازی مواد و وسایل لازم
در این تحقیق برای ثبت پتانسیل های میدانی برانگیخته درمسیر پرفورنت الکترود دو قطبی تحریکی و در شکنج دندانه دار الکترود ثبات قرار داده شد و برای تزریق دارو نیز در داخل بطن جانبی یک کانول کار گذاشته ‌شد. بنابراین، قبل از انجام جراحی حیوانات، باید الکترودها و کانول های لازم برای جراحی تهیه می گردید.

۳-۱-۱- تهیه الکترود
برای انجام آزمایش به یک الکترود دو قطبی و یک الکترود تک قطبی برای هر حیوان نیاز بود. این الکترودها از به هم تاباندن طول مناسبی از دو رشته سیم الکترود (با قطر ۱۲۷ میکرون) از جنس فولاد ضد زنگ Stainless steel با پوشش تفلونی تهیه می شد. عایق انتهای سیم ها به اندازه ۲۵/۰ تا ۵/۰ میلیمتر برداشته شده و سپس به پین لحیم می گردیدند. از این الکترودها برای تحریک مسیر پرفورنت و ثبت از شکنج دندانه دار استفاده می شد.
پس از ساختن الکترودها، برای اطمینان از سالم ماندن پوشش عایق سیم الکترود یک سر اهم متر را به پین وصل نموده و سر دیگر آن که به یک حلقه فلزی متصل بود، در آب فرو برده می شد تا یک لایه از آب سطح حلقه را بپوشاند. سپس الکترود از میان حلقه فلزی و لایه آب عبور داده می شد. اگر در طول الکترود پوشش عایق از بین رفته بود، جریان برقرار می گردید و اهم متر آن را نشان می داد.
۳-۱-۲- تهیه کانول
برای تزریق دارو به داخل بطن جانبی از سرسوزن G 27 دندانپزشکی به عنوان کانول تزریق و از سر سوزن G 22 به عنوان کانول راهنما استفاده می‌گردید. پس از اینکه سر سوزن G 22 به طول مناسب بریده می‌شد، طول سر سوزن G 27 به گونه‌ای اندازه گیری می گردید که پس از قرار گرفتن در کانول راهنما (سرسوزن G22) نوک آن به اندازه یک میلی متر از نوک کانول راهنما بلندتر باشد. به منظور قرار گرفتن کانول تزریق در محل مورد نظر، کانول راهنما هنگام جراحی در فاصله یک میلی متر بالاتر از منطقه مورد نظر قرار گرفته و توسط سیمان دندانپزشکی ثابت می‌شد.
۳-۱-۳- آماده سازی دارو
۳-۱-۳-۱- داروی مورد استفاده
در این تحقیق از WAY-100635 (CPT؛ خریداری شده از شرکت Sigma) به عنوان آنتاگونیست اختصاصی گیرنده سرتونینی ۵-HT1A استفاده شد.
۳-۱-۳-۲- تهیه دوزهای مختلف دارو
دارو برای تزریق به داخل بطن جانبی مغز در مایع مغزی- نخاعی مصنوعی (حلال دارو) حل می‌شدند. مواد تشکیل دهنده حلال دارو عبارت بود از: NaCl (114mM)، MgSO₄ (۲mM)، KCl (3mM)، NaH₂PO₄ (۱٫۲۵mM)، CaCl₂ (۱mM)، NaHCO₃ (۲۶ mM) و Glucose (10mM).
هنگام تهیه حلال دارو، گلوکز و NaHCO₃ مدت کوتاهی قبل از تزریق دارو به محلول فوق اضافه می‌شدند، زیرا وجود گلوکز محیط مناسبی برای رشد باکتری‌ها و قارچها فراهم می‌کند و NaHCO₃ پایدار نیست و CO₂ را از دست می‌دهد. پس از تهیه حلال دارو، برای تهیه دوزهای مختلف دارو، ابتدا مقدار مورد نیاز از دارو وزن شده، در حجم معینی از حلال دارو حل می‌گردید و سپس با بهره گرفتن از pH متر و HCl یک نرمال، pH محلول در حد ۴/۷-۲/۷ تنظیم می‌شد.
به منظور استریل کردن، دارو از میکروفیلتر( μm2/0) ساخت شرکت Scheicher & Schuell آلمان گذرانده شده و درون ظرفهای شیشه‌ای استریل ریخته می‌شد. این کار در مجاورت شعله چراغ الکلی صورت می‌گرفت تا هوای محیط نیز استریل گردد. از حلال دارو استریل شده کهpH آن تنظیم شده بود، به عنوان محلول شاهد استفاده می‌شد.
در این تحقیق از غلظتهای ۵/۱۲، ۲۵ و ۵۰ (میلی گرم به ازای یک کیلوگرم) حیوان استفاده شد.
۳-۲- جراحی حیوانات
در این تحقیق از موشهای صحرایی نر از نژاد Wistar در محدوده وزنی ۲۲۰-۳۲۰ گرم استفاده شد. پس از آماده کردن وسایل جراحی استریل شده، حیوان توسط سدیم پنتوباربیتال (mg/kg 40، داخل صفاقی) بیهوش می گردید(وادا ^[۹۹]و همکاران،۱۹۹۳).
موشهای مورد نظر از خانه حیوانات واقع در دانشگاه علوم پزشکی سبزوار (معاونت آموزشی و تحقیقات و فن آوری) تهیه شدند. تمام شرایط نگهداری بر اساس کمیته اخلاق دانشگاه در مورد اصول کار با حیوانات رعایت شد. دما در محدوده ۱±۲۲ درجه سانتی گراد و زمان روشنایی ۷ صبح تا ۷ شب بود. غذا و آب به طور کامل در دسترس حیوانات بود و هر ۴ حیوان در یک قفس نگه داری می شدند.
موهای سر حیوان تراشیده شده و حیوان در دستگاه استریوتاکس قرار می گرفت. بعد از ثابت کردن سر حیوان و شستشوی پوست سر با بتادین، برشی در خط وسط با تیغ جراحی ایجاد می شد و سطح استخوان جمجمه با الکل تمیز می گردید تا نقطه برگما مشخص شود. موقعیت مسیر پرفورنت برای قرار دادن الکترودهای تحریکی در سطح جمجه نسبت به برگما (بر حسب میلیمتر: ۹/۶-AP= 1/4+L= و ۷/۲ تا۴/۲V= نسبت به سطح استخوان جمجمه) و همچنین ژیروس دندانه دار برای قرار دادن الکترود ثبات نسبت به برگما (بر حسب میلیمتر: ۸/۲- AP= ، ۸/۱+L= و ۵/۳ تا ۲/۳ V=نسبت به سخت شامه) تعیین می گردید. موقعیت بطن جانبی راست (برای قرار دادن کانول راهنما) نیز مشخص می شد (بر حسب میلیمتر: ۹/۰-AP= ، ۵/۱+L= نسبت به برگما و ۲/۳V= نسبت به سطح سخت شامه)(پاکسینوس و واتسون^[۱۰۰]،۱۹۸۹).
پس از تعیین دقیق نقطه های فوق بر روی جمجمه با بهره گرفتن از مته دستی، جمجمه را در آن نقطه سوراخ کرده و سپس الکترودهای تحریک و ثبات و کانول راهنما به ترتیب در محل های تعیین شده قرار می گرفتند. با بهره گرفتن از استیمولاتور، تحریک الکتریکی با شدت ۵۰ میکروآمپر تا ۱ میلی آمپر از طریق الکترود تحریک به مسیر پرفورنت اعمال می شد. در صورت قرار داشتن الکترودها در محل مناسب، به دنبال اعمال تحریک با یک تک پالس fEPSP ثبت می گردید، در غیر این صورت موقعیت الکترودهای تحریک و ثبات آنقدر تغییر داده می شد تا یک fEPSP با حداکثر دامنه (بین ۱۰-۳ میلی ولت) ثبت شود. سپس با سیمان دندانپزشکی کانول راهنما‍ و الکترودها بر روی جمجمه حیوان ثابت می گردیدند.
۳-۳- تحریک حیوانات
برای ثبت پتانسیلهای میدانی مسیر پرفورنت تحریک و از سلولهای گرانولی ژیروس دندانه دار ثبت به عمل می آمد (شکل۳-۱). از دستگاه تحریک برای تحریک حیوانات (کیندلینگ و LFS) استفاده می شد. مسیر پرفورنت توسط الکترودی که در آن کار گذاشته می شد تحریک می گردید. الگوی تحریک به این ترتیب بود: ۱/۰ هرتز، مدت زمان هر پالس ۱۰۰ میکرو ثانیه و شدت پالس آزمون (Test pulse؛ شدتی که در آن ۵۰% حداکثر پاسخ به دست آید).
شکل۳-۱: نمونه ای از ثبت پتانسیل میدانی ناحیه شکنج دندانه دار پس از تحریک تک پالس
۳-۴- ثبت پتانسیلهای میدانی
برای ثبت کمیتهای الکتروفیزولوژیک از آمپلی فایر، برد A/D و برنامه نرم افزاری Neurotrace ساخت شرکت پرتودانش که مخصوص ثبت EEG و پتانسیلهای میدانی است؛ استفاده می شد. درهر آزمایش شیب پتانسیل های میدانی پس سیناپسی تحریکی^[۱۰۱](fEPSP)، (شیب خط خاکستری در نمونه ثبت شکل ۳-۱) و دامنه اسپایک های تجمعی^[۱۰۲]( PS) که میانگین جمع جبری مقادیر خطوط نقطه چین در (شکل ۳-۱) می باشد محاسبه می شد.
۳-۵- روش تزریق دارو
برای تزریق دارو به داخل بطن جانبی، از لوله پلی اتیلنی PE-20 (ساخت شرکت Stoelting،آمریکا) که یک سر آن به سر سوزن G 27 متصل شده بود، استفاده گردید. قبل از تزریق دارو، لوله مزبور و سرسوزن که ابتدا با آب مقطر استریل و سپس با داروی استریل شستشو داده می‌شدند، از دارو پر شده سپس لوله پلی اتیلنی به سرنگ‌ هامیلتون متصل می گردید. در نهایت سرنگ ‌هامیلتون در محل مخصوص بر روی دستگاه تزریق Microsyring pump)؛ ساخت شرکت Stoelting آمریکا) قرار می‌گرفت و سرعت تزریق روی ۵/۰ میکرولیتر در ۲ دقیقه تنظیم می‌شد (شکل ۳-۲).
شکل۳-۲: نحوه تزریق دارو به داخل بطن جانبی با بهره گرفتن از پمپ تزریق (a) و سرنگ هامیلتون (b)
۳-۶- کیندلینگ حیوانات بوسیله PTZ
به منظور ایجاد کیندلینگ تزریق داخل صفاقیPTZ (mg/kg 37)) خریداری از شرکت سیگما، آلمان) هر ۴۸ ساعت یک بار صورت می گرفت. به دنبال تزریق PTZ مراحل تشنجی در حیوان ظاهر می شد. این مراحل به صورت پیشرونده با تکرار تزریقات تا مرحله ۵ (آخرین مرحله از درجه بندی راسین) می رسید(راسین،۱۹۷۲). به بیان دیگر در تزریق های اولیه مراحل ۱ تا ۲ و در تزریق های بعدی مراحل بالاتر تشنجی بروز می کرد. کمیت های قابل اندازه گیری و قابل قیاس آماری در این تحقیق عبارت بودند از: مدت زمان تأخیری تا بروز اولین مرحله تشنج (Stage 1 Latency; S1L)، مدت زمان تأخیری تا مرحله ۴ تشنج (Stage 4 Latency; S4L) و مدت زمان مرحله ۵ تشنج (Seizure 5 Duration; S5D) ثبت می شد.
۳-۷-گروه های آزمایشی
به صورت تصادفی ۵ گروه موش صحرایی نر نژاد Wistar در محدوده وزنی ۲۲۰ تا ۳۲۰ گرم انتخاب شدند (هر گروه ۴ سر). گروه های آزمایشی به قرار زیر بودند:
گروه اول: این حیوانات بدون هیچ گونه مداخله ای برای جراحی استرئوتاکسیک آماده شدند. نقاط مربوط به تحریک (مسیر پرفورنت) و ثبت (شکنج دندانه ای) و تزریق دارو یا ACSF (بطن جانبی) بر اساس اطلس پاکسینوس مشخص شد. پس از قرار دادن الکترودهای دوقطبی در مسیر پرفورنت و الکترود ثبات در شکنج دندانه دار، شدت پالس آزمون تعیین شده و به مدت ۲۰ دقیقه ثبت پایه پتانسیل های میدانی با تک پالس(LFP)انجام گردید. پس از ثبت پتانسیل های میدانی تحریک تتانیک جهت ایجاد LTP القا شد. پس از اعمال تحریک تتانیک، دوباره ثبت پتانسیل های میدانی به مدت ۲۰ دقیقه انجام گرفت. قبل از القای LTP یک میکرولیتر ACSF نیز به داخل بطن جانبی تزریق شد (شکل۳-۳).
۲۰ دقیقه ثبت LFP
جراحی حیوان و ثبت fEPSP
تعیین Test Pulse
تزریق ACSF
القای LTP
۲۰ دقیقه ثبت LFP
شکل۳-۳: پروتوکل زمانی گروه۱(غیرکیندل)از آغاز جراحی تا آخرین ثبت گرفته شده. این گروه PTZ و WAY-100635 دریافت نکرده است.
۲- گروه دوم: تمام مراحل انجام آزمایش مشابه گروه اول بود با این تفاوت که حیوانات قبل از جراحی طی دوره یک ماهه تزریق PTZ کیندل شده بودند(شکل۳-۴).
جراحی حیوان کیندل شده و ثبت fEPSP
تعیین Test Pulse
تزریق ACSF
القای LTP
۲۰ دقیقه ثبت LFP