وبلاگ

این نقاط ضعف باعث بوجود آمدن روش میکروبیولوژی کلاسیک همانند^[۳۹] PCRکه با حساسیت بالا و سریع تر از روش های میکروبیولوژی دیگر قابل اجراست، خواهد شد.
۱-۸-۱۰-۲-۶- انواع PCR
۱-۸-۱۰-۲-۶-۱- Mutiplex PCR
در این روش حضور بیش از یک نوع فاژ مورد بررسی قرار می گیرد. در سال ۲۰۰۰ labrie, Moineau این روش را طراحی کردند تا تنها توسط یک واکنش مجرد حضور ۳ گونه فاژ لاکتوکوکوس لاکتیس تشخیص داده شود.
۱-۸-۱۰-۲-۶-۲- Quntitive PCR (q PCR)
ذرات فاژ را در نمونه سریع تر و حساس تر از pcr سنتی شناسایی می کند. این روش حضور فاژ را به صورت روتین در محصوات لبنی شناسایی می کند و همچنین استراتژی های کنترل آلودگی به فاژ را شامل می شود. این روش به شناسایی مستقیم فاژ حتی در مقادیر کم نمونه های صنعتی نیز می پردازد همچنین این روش، روشی کیفی می باشد.
۱-۸-۱۰-۲-۶-۳- Traditional PCR
یک تکنیک بیولوژی –مولکولی است که به طور وسیع استفاده می شود. در سال ۱۹۸۳ توسط کری مولیس و همکارانش این روش توسعه یافته است در این روش یک یا تعداد کمی کپی از ذرات DNA اختصاصی در نمونه توسط DNA پلی مراز تقویت می شود و در یک سیکل حرارتی ۲۳۵ کپی یا بیشتر در مدت زمان کوتاه تولید می شود. در انتها واکنش تقویت شده روی ژل آگارز آنالیز شده و ذرات DNA بر اساس اندازه ژنوم جدا می شوند. این تکنیک برای شناسایی فاژ در نمونه های شیر ، آب پنیر در کارخانه ها یا حتی نمونه های هوا استفاده می شود و مقادیری حدود ۱۰^۴-۱۰^۳ ذره فاژ در لیتر را جداسازی می کند.

۱-۸-۱۱- کنترل فاژ
از زمانی که مشکل فاژ برای اولین بار تشخیص داده شد تولیدکنندگان و دانشمندان راهبردهای مختلفی را برای جلوگیری و یا حداقل کاهش ابتلا به فاژها ارائه داده اند.
بواسطه ی پیشرفت در بیولوژی مولکولی و بیوتکنولوژی توسط افرادی در استرالیا، نیوزلند، هلند، انگلستان، آمریکا و سوئیس در طی دو قرن گذشته تحقیقات بر روی باکتریوفاژ به سطح قابل قبولی رسیده است و از این برنامه های تحقیقاتی راهبردهای کنترلی زیادی بدست آمده است. قبل از پرداختن به این روش ها لازم به ذکر است که از محیط تکثیر کشت آغازگر، مکان تولید پنیر که بخوبی استریل شده باشند و نقاط ورودی فاژ که تا حد امکان محدود شده باشند، اطمینان حاصل شود . فاژها به هیپوکلریت و گرما حساس هستند و از این طریق می توانند از تجهیزات و محیط های کشت زدوده شوند.
فاژها می توانند از طریق پخش شدن آب پنیر، هوا و توسط افراد منتقل شوند بنابراین این موارد نقاط کنترلی مهمی میباشند. در نتیجه تا زمانی که یک تولید کننده شرایط بهداشتی عالی را به کار نگیرد و سیستم های مناسب انتقال هوا در محیط وجود نداشته باشد( مثل فیلترهای HEPA، فشار مثبت در اتاق کشت و غیره) و محل انجام فرایند بر روی آب پنیر از سالن جدا نگردد تا عبور و مرور افراد محدود شود، فناوری پیشرفته برای برای کنترل فاژها شانس کمی برای موثر بودن خواهد داشت. حتی وقتی برنامه های مناسب بهداشتی اجراء می شوند، فاژها از محیط ساخت پنیر حذف نمی شوند و هر جائیکه باکتری های اسید لاکتیک در حال رشد وجود دارند، فاژها نیز حضور دارند و به آن ها نیز حمله می کنند. با توجه به این واقعیت سازندگان مایه کشت نوع جدیدی از محصولات را ارئه کرده اند که رشد فاژها را کنترل و یا متوقف می کنند.که شامل:
محیط های کشت بازدارنده فاژها
مایه کشت مقاوم به فاژ
برنامه های چرخشی مایه کشت
تانک مایه کشت انبوه، اولین مکانی است که تکثیر فاژ در آن اتفاق می افتد به طور سنتی از شیر یا آب پنیر بعنوان محیط کشت استفاده می شود علاوه بر اینکه باکتری های اسید لاکتیک به خوبی رشد می کنند، رشد فاژها نیز بخوبی صورت می گیرد. برعکس محیطهای کشت بازدارنده فاژ هم محیط هایی با پایه آب پنیر یا پایه شیر هستند اما علاوه بر فاکتورهای تغذیه ای و رشد، حاوی نمکهای فسفات و سیترات می باشند. با وجود استفاده گسترده از این روش اثرات کمی بر کنترل فاژ مشاهده می شود.
میکروبیولوژیست های لبنی از مدتها به دنبال لاکتوکوکسی ها و سایر باکتری های اسید لاکتیک هستند که به طور طبیعی در مقابل فاژ مقاوم باشند گرچه چنین نژادهایی وجود دارند ولی فاقد خواص لازم برای ساخت محصولات لبنی هستند آنها یا رشد کندی داشته یا محصولی با کیفیت پایین تولید می کنند و یا در انتهای عمل به فاژ آلوده می شوند.
یک روش موفقیت آمیز دیگر ایزوله کردن نژادهای خودبخود جهش یافته مقاوم به فاژ می باشد که با در معرض قرار دادن مداوم نژادهای تولید کننده محصول لبنی در برابر فاژهای دائمی حاضر در محیط مشخص بدست می آیند. برای اطمینان از اینکه خواص تخمیری دچار تغییر نشده است باید آن ها را برای سرعت تولید اسید در زمان در معرض فاژها، تحت شرایط مشابهی که برای تولید محصول لبنی استفاده می شود قرار داد که از آزمون هیپ و لورنس ( روش هیپ و لورنس، برگرفته از نام دو محقق نیوزلندی ) که قوی ترین و موثرترین روش برای توسعه محیط های کشت مقاوم به فاژ می باشداستفاده شود. مکانیسم های متفاوتی برای فنوتیپ مقاوم به فاژ در باکتری های اسید لاکتیک شناسایی شده است. به طور کلی نژادهای مقاوم به فاژ، فرایند ابتلا را در یکی از چند مرحله از چرخه لیتیک متوقف می سازند.
ژن هایی که مسئول بسیاری از صفات در لاکتوکوکسی ها هستند بر روی پلاسمید قرار دارند. بنابراین این امکان وجود دارد که پلاسمیدهای مربوطه از یک باکتری به باکتری دیگر منتقل شوند و یک فنوتیپ مقاوم به فاژ در نژاد دریافت کننده ایجاد کنند. پلاسمید PTRK2030 مسئول چندین مکانیسم مقاوم به فاژ می باشد.(۶۱ ،۴۵)
۱-۹- مقاومت آنتی بیوتیک:
پروبیوتیک ها میکروارگانیسم های زنده ای هستند که اگر به اندازه ی کافی استفاده شوند برای سلامتی انسان اثر مفید دارند. بسیاری از گونه های میکروبی دارای خصوصیات پروبیوتیک هستند که در این بین لاکتوباسیل ها دارای قدمت طولانی می باشد که در تولید غذاهای تخمیری و آشامیدنی ها دخیل هستند.
بیش از یک دهه است که اثر سود بخشی سویه های پروبیوتیک بر روده و سلامت انسان با گسترش مصرف غذاهای پروبیوتیک در جهان افزایش یافته است بنابراین آگاهی از ایمنی لاکتوباسیل هایی که به عنوان محصولات پروبیوتیکی استفاده می شوند ضروری است. روده انسان زیستگاه طبیعی مجموعه باکتری های دینامیکی است که ارتباط مستقیم با سلامت انسان دارند.
میکروفلور روده انسان اکوسیستم پیچیده ای است که از حدود۱۰^۱۴ سلول باکتری که باکتروئید ها، یوباکتر، بیفیدوباکتر، رامنوکوکوس و کلستریدیوم اکثریت غالب را تشکیل می دهند، بوجود آمده است. تنوع زیادی از ژن های مقاوم به آنتی بیوتیک از میکروبیوم ^[۴۰]روده انسان جداسازی شده است. در صورتی که سویه های پروبیوتیک، داخل روده با میکروفلور ذاتی روده بر هم کنش کنند انتقال ژن های مقاوم به آنتی بیوتیک صورت می گیرد. گسترش ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی سبب کاهش درمان بیماران عفونی خواهد شد. این مربوط به ژن های مقاوم به آنتی بیوتیکی قابل انتقال لاکتوباسیل هاست که یا به عنوان سویه های پروبیوتیک یا استارتر در تولید غذاهای تخمیری استفاده می شود. (۵۱) در نتیجه گسترش مقاومت
آنتی بیوتیکی در باکتری های پاتوژن سبب طولانی شدن دوره درمان می شود و همچنین هزینه های هنگفتی برای درمان این افراد صرف خواهد شد.(۲۰) لذا در این راستا چون سویه های بومی هر منطقه نسبت به سویه های غیر بومی دارای خواص کاربردی بهتری هستند بررسی امنیت این سویه ها از اهمیت زیادی برخوردار است. (۲۴و۲۶)
با توجه به مطالب ذکر شده در این مطالعه به بررسی الگوی حساسیت آنتی بیوتیکی ۶۵ سویه لاکتوباسیل جداشده شده از محصولات لبنی سنتی تولید شده در مناطق جغرافیایی مختلف ایران پرداخته می شود.
بر اساس نتایج ارائه شده در کمیته بین المللی غذای اروپا^[۴۱] برای ارزیابی ایمنی اسید لاکتیک باکتری ها در محصولات لبنی که به عنوان پروبیوتیک یا استارتر استفاده می شوند یکی از راه هایی که پیشنهاد میگردد تعیین پروفایل مقاومت آنتی بیوتیکی با بهره گرفتن از روش دیسک دیفیوژن است. (۵۱)
چنانچه مقاومت ذاتی و ناشی از جهش کروموزومی باشد غیر قابل انتقال و یا اینکه میزان انتقال به قدری پایین است که قابل چشم پوشی است و در صورتی که ژن مقاومت اکتسابی باشد با نرخ قابل توجهی قابل انتقال خواهد بود که با آزمون mating انتقال ژن مقاومت می توان به آن پی برد. اگر ^۵-۱۰ تا ^۶- ۱۰ ژن هم یوغی شود و انتقال پیدا کند آن سویه معمولا برای محصولات میکروبیال استفاده نخواهد شد .(۵۱)
۱-۹-۱- مقاومت آنتی بیوتیکی لاکتوباسیل های پروبیوتیک:
مقاومت به آنتی بیوتیک مشکلی است که به طور جهانی افزایش پیدا کرده است که ناشی از فشار های انتخابی^[۴۲] استفاده از آنتی بیوتیک است.(۵۰)
فشار های انتخابی:
استفاده به عنوان شیمی درمانی
استفاده معدود مجموعه ی آنتی میکروبیال ها برای انسان
استفاده نابجا و سوء استفاده از آنتی بیوتیک ها برای درمان انسان
استفاده از آنتی بیوتیک ها در کشاورزی و استفاده نابجا از آن ها
استفاد از آنتی بیوتیک های ضعیف
پراکندگی میکروارگانیسم های مقاوم
عدم کنترل کافی در مراقبت های بهداشت
فقدان نظارت و در نهایت تاخیر در جداسازی(۹)
بسیاری از محصولات غذائی توسط فرایند های تخمیری باکتری ها لاکتیک اسید بوجود می آیند. مشکل جدی انتقال ژن های مقاوم به سویه های پروبیوتیک است.
از لحاظ ایمنی مقاومت آنتی بیوتیکی ذاتی و اکتسابی باید قابل تمیز باشند.
۱-۹-۲- انواع مقاومت آنتی بیوتیک
مقاومت آنتی بیوتیکی به دو صورت است:
مقاومت طبیعی : یک ویژگی اساسی گونه های باکتری بوده و تمامی افراد یک گونه را شامل می شود و بستگی به مواجهه قبلی با آنتی بیوتیک ندارد. این نوع مقاومت ناشی از وضعیت فیزیولوژیک، بیوشیمیایی یا مورفولوژیک ذاتی و خاص باکتری است که مانع از اثرات آنتی بیوتیک می شود. تشخیص این مقاومت آسان است بطوری که در مواجهه کم ارگانسیم، با آنتی بیوتیک مشخص می گردد.
مقاومت اکتسابی: مقاومتی است که قبلا نسبت به دارو حساس بوده و در مواجهه قبلی مقاوم شده است. این مواجهه باعث ایجاد فشارهای انتخابی می شود که موجب رشد بیش از حد و سریع سلول های مقاوم و ظهور یکسری سلول های مقاوم می گردد. (۳۲)
۱-۹-۳- انتقال افقی ژن های لاکتوباسیل های پروبیوتیک:
پروبیوتیک ها به انتقال ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی به باکتری های کامنسال روده یا پاتوژن های حاضر در روده کمک می کنند. حضور ژن های مقاوم به آنتی بیوتیک قابل انتقال در میکروفلور روده یک پدیده ناخواسته است که این خطرات، بالقوه توسط حضور پاتوژن ها در روده و درمان آنتی بیوتیکی ناقص بدست می آید.
عناصر خارج کروموزومی مانند پلاسمید های کانجوگیتیو و ترانسپوزون ها ژن های مقاومت به آنتی بیوتیک را در لاکتوباسیل ها انتقال می دهند. انتقال از لاکتوباسیل ها به باکتری های کامنسال دیگر در شرایط Invitro صورت می گیرد. (۵۱)
۳ مکانسیم برای انتقال افقی ژن ها وجود دارد:
کانجوگیشن (هم یوغی) : اغلب برای انتقال مقاومت به میکروب های گاستروانتریت با اهمیت است. این مکانیسم توسط عناصر ژنتیکی متحرک ^[۴۳] مثل پلاسمید و ترانسپوزون از یک باکتری زنده، توسط تونل های پروتئینی که موقتا به باکتری متصل شده به باکتری دیگر انتقال پیدا می کند. در باکتری های گرم منفی توسط پیلی های جنسی در حالی که در باکتری ها ی گرم مثبت توسط ساختارهای سطحی سلول این انتقال صورت می گیرد.
ترانس فورمیشن: ساده ترین روش انتقال است که در آن، DNA رها شده از یک باکتری توسط باکتری دیگر برداشته می شود.
ترانسداکشن: مکانسیم انتقال DNA از یک باکتری به باکتری دیگر که با واسطه ی باکتریوفاژ صورت می گیرد. ترانسداکشن فراوانی زیای در رودخانه ها، آب دربا و خاک دارد. دو نوع مکانسیم ترانداکشن وجود دارد:
ترانداکشن عمومی^[۴۴] :ذرات درون DNA سر باکتریوفاژ بسته بندی شده است. برخی از تراسداکشن های باکتریوفاژ فقط کروموزومال یا DAN پلاسمیدی است وهیچ DNA باکتریوفاژی وجود ندارد. در حالی که برخی دیگرDNA باکتریوفاژ و DNAخارجی است. اندازه سر باکتریوفاژ تعیین کننده مقدار DNA که می تواند درون سر بسته بندی شود و توسط ترانسداکشن انتقال پیدا می کند.
ترانسداکشن خصوصی^[۴۵]: یک یا چند ژن باکتریوفاژ توسط DNA باکتریایی میزبان جایگزین می شود و انتقال پیدا می کند. (۵۰، ۸ )
۱-۹-۴- عوامل ضد باکتریایی
۱-۹-۴-۱- آنتی بیوتیک ها:
آنتی بیوتیک ها ترکیباتی هستند که توسط میکروارگانیسم های مختلف تولید می شود و در نتیجه سبب مرگ یا توقف رشد باکتری ها می شود. فلمینگ اولین کسی بود که متوجه شد قارچ پنی سیلیوم از تکثیر استافیلوکوک ها جلوگیری می کند. کنسانتره ای از کشت این قارچ تهیه شده و فعالیت قابل توجه ضد باکتریال و فقدان سمیت اولین آنتی بیوتیک یعنی پنی سیلین نشان داده شده است. (۶۳)
آنتی بیوتیک ها به چند دسته تقسیم می شوند: پنی سیلین ها، سفالوسپورین ها، تتراسایکلین ها، آمینوگلیکوزیدها، فلوروکینولونها، ماکرولیدها و سولفونامیدها از مهمترین آنها هستند.