وبلاگ

مراحل انجام کار به شکل زیر است:
۱- یک میکروتیوب ۲/۰ برداشته و محتویات واکنش به صورت زیر در آن مخلوط گردد.
آب استریل: ۱۲ میکرولیتر
بافر تنگو x2 : 4 میکرولیتر
آنزیم NcoI: 1 میکرولیتر
آنزیم XhoI: 1 میکرولیتر
پلاسمید pet-28aنوترکیب: ۲ میکرولیتر
حجم نهایی واکنش:۲۰ میکرولیتر
۲- میکروتیوب به مدت ۱ الی۲ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد ( دمای اپمتیوم واکنش آنزیم ها ) قرار داده شود.
۳-الکتروفورز انجام داده تا قطعات پلاسمید و ژن ناحیه VپروتئینALCAMشناسایی وتایید شوند.
۳-۶ بیان پروتئین ناحیهVپروتئینALCAM
پس از تائید ترانسفورماسیون و وجود پلاسمید حاوی ژن ناحیه VپروتئینALCAMدر باکتری میزبان، با توجه به پروموتر lacدر پلاسمید pet-28a ، جهت القاء بیان پروتئین در باکتری از القاگر IPTGدر رقت مناسب استفاده شد.
۳-۶-۱ القاء بیان پروتئین به کمک IPTG
مراحل کار بصورت زیر می باشد:
۱) به ۲ میلی لیتر از محیط کشت LBحاوی انتی بیوتیک کانامایسین ، λ۲۰ از باکتری BL21(DE3)ترانسفورم شده اضافه شد و به مدت یک شب در شیکر انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد و با سرعت rpm150 قرار داده شد وبه ان اجازه داده شد تا رشد کند.
۲) λ ۲۰ از مخلوط مورد نظر به ۲ میلی لیتر از محیط کشت LBتازه حاوی انتی بیوتیک کانامایسین اضافه شد و به مدت ۲ ساعت در شیکر انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد با سرعتrpm150 قرار داده شد تا غلظت باکتری مورد نظر به ODبه ۸/۰ برسد. بدین طریق باکتری ها تازه گشته و در فاز لگاریتمی خود قرار دارند.
۳) λ۲۰ از القاگر IPTGبا غلظت ۱۰۰ میکروگرم در میلی لیتر به ۲ میلی لیتر از محیط کشت حاوی باکتری ترانسفورم شده اضافه شد و سپس به مدت ۶ ساعت در شیکر انکوباتور ۳۷ درجه سانتیگراد با سرعت rpm150 قرار داده شد.
نکته: نمونه های کنترل منفی بدون افزوده شدن IPTGمورد بررسی قرار گرفتند.
۴) مخلوط مورد نظر به مدت ۵ دقیقه در ۴ درجه و با سرعت rpm5000 سانتریفیوژ شد.
۵) محلول روئی را دور ریخته و به رسوب ان λ۶۰ اوره ۸ مولار اضافه شد و به کمک تکنیک SDS-pageبیان پروتئین مورد نظر مورد بررسی قرار گرفت.
۳-۶-۲ بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page
به منظور جداسازی باند های پروتئینی سلولی و ردگیری پروتئین نوترکیب در سلول های ترانسفورم شده و نیز میزان بیان پروتئین مورد نظر از الکتروفورز بر روی ژل پلی اکریل امید استفاده شد و عصاره های سلولی تهیه شده بر روی SDS-pageالکتروفورز شدند. با توجه به این که وزن مولکولی پروتئین نوترکیب حدود ۲۳ کیلو دالتون می باشد از ژل %۱۵ استفاده کردیم . برای بررسی بیان پروتئین نوترکیب از کیت SDS-page ساخت شرکت سیتومتین ژن اصفهان استفاده شد.

۳-۶-۲-۱ محتویات کیت SDS-page
محلول ذخیره آکریل امید و بیس آکریل امید ۴۰% : ۴۰ میلی لیتر
محلول بافر Running 10X : 25 میلی لیتر
محلول بافر Stacking 10X : 10 میلی لیتر
پودر محلول ذخیره SDS 10% : 5 میلی لیتر
پودر محلول ۱۰% آمونیوم پرسولفات (APS) : 5 میلی لیتر
پودر بافر Tank 10X : 400 میلی لیتر
محلول بافر ۲X SDS gel loading : 2 میلی لیتر
محلول رنگ آمیزی کوماسی بلو : ۳۰۰ میلی لیتر
محلول رنگ بر کوماسی بلو : ۴۰۰ میلی لیتر
محلول TEMED : 1 میلی لیتر

روش انجام SDS-page :
الف-اسلایدهای شیشه ای مخصوص ساخت ژل را به خوبی شسته و در نهایتا برای حذف هر گونه آلودگی به اتانول تمیز شود.
ب-سپس اسلایدهای شیشه ای در داخل سلول مخصوص خود قرار داده و برای اطمینان از عدم نشت ژل ، مقداری اتانول در اسلایدهای شیشه ای ریخته ، به مدت ۱۰ دقیقه در آن قرار گیرد. در صورت عدم نشت با احتیاط ، اتانول واقع در اسلایدهای شیشه ای دور ریخته شود.
پ-بسته به وزن مولکولی پروتئین موردنظر بر اساس جدول ۱ ، اقدام به ساخت ژل Running کنید.
نکته: ژل ساخته شده را در اسلاید شیشه ای ریخته تا حدی که ۲ سانتی متر با سطح اسلاید فاصله داشته باشد. بلافاصله بعد از ریختن ژل ، بر روی سطح ژل ، ایزوپروپانول یا اتانول ریخته تا شرایط بی هوازی برای فعالیت TEMED فراهم شده و همچنین سطح ژل را صاف نماید. برای اطمینان از بسته شدن ژل ، مقدار اضافی ژل را در یک لوله اپندورف ریخته و درب آن را محکم ببندید.
بلافاصله بعد از اضافه کردن TEMEDنکته: ژل شروع به پلیمریزه شده می کند. بنابراین بایستی مواد به ترتیب از بالا به پایین اضافه شود و پس از اضافه کردن TEMED سریعا مخلوط و به فضای بین دو اسلاید شیشه ای اضافه شود. در هنگام ریختن ژل بین اسلایدهای شیشه ای از ایجاد حباب هوا بایستی جلوگیری شود.
ت- وقتی که ژل در داخل لوله اپندورف پلیمریزه شد (حدود ۳۰ تا ۶۰ دقیقه طول می کشد) ، ژل Stacking بر اساس جدول ۲ ساخته شده ، ایزوپروپانول را از سطح ژل دور ریخته و سپس ژل Stacking را تا سطح اسلاید اضافه و بلافاصله شانه تفلونی بر روی اسلاید قرار گیرد.
ث- همانند مرحله قبل مقدار اضافی ژل را در یک لوله اپندورف ریخته و درب آن بسته می شود (مدت زمان بسته شدن همانند مرحله قبل)
ج-وقتی که ژل بسته شد ، در تانک در حدود ۱ لیتر بافر ۱X Buffer Running Tank ریخته و اسلایدهای شیشه ای را همراه با گیره آن درون تانک قرار دهید. پس از اینکه بافر تانک سطح ژل را کاملا پوشاند به آرامی شانه را از ژل خارج نمایید.
ح-در حین بستن ژل اقدام به آماده سازی نمونه ها شود به این صورت که نمونه ها را با نسبت برابر با بافر بارگذاری مخلوط و به مدت ۷ دقیقه جوشانده شود.
خ-در چاهک نخست ۵ میکرولیتر از مارکر پروتئین و در چاهک های بعدی ، بقیه نمونه ها ریخته شوند.
چ-درب تانک را بسته سپس منبع تغذیه به تانک وصل گردد.
د- منبع تغذیه را در ۵۰ میلی آمپر تا زمانی که نمونه ها به فصل مشترک ژل Stacking و ژل Running برسد ، تنظیم شود.