وبلاگ

در مطالعه حاضر مشاهده شد که گیاهچه های رشد کرده در محیط های دارای غلظت ۵/۰ ppm نانو نقره، از نظر برخی شاخص های ظاهری و به طور کیفی، به مراتب رشد بهتر و مطلوب تری را نسبت به محیط MS (کنترل) داشته اما غلظت های ۵/۱ و ۲ میلی گرم در لیتر نانو نقره شدیداً باعث کاهش برخی از شاخص های رشد گیاهچه های سیب زمینی رقم وایت دزیره شد. به عنوان مثال کاهش طول ساقه و فاصله میان گره ها در اثر عملکرد نانونقره به عنوان مهار کننده فعالیت اتیلن می تواند بیان گر این مطلب باشد که فرایند طویل شدگی سلول ها در حضور نانونقره کاهش یافته است. در مورد مکانیسم عمل نقره در کاهش فاصله میان گره ها اطلاعات دقیقی در دست نیست(Aidid and Okamato ۱۹۹۲) ولی مقایسه ی اثر نانو نقره با اثر برخی از فلزات سنگین نظیر کادمیوم بر رشد گیاه نشان می دهد که فلزات سنگینی چون کادمیوم( Toppi and Gabbrielli۱۹۹۹) سرب و روی باعث کاهش رشد طولی سلول ها ی ساقه ی گیاه شده است(Aidid and okamato ۱۹۹۲). البته بایستی در نظر داشت مطالعات حاضر در شرایط کشت در شیشه و تجمع اتیلن انجام شده در حالیکه در مطالعات سایر محققان روی برخی از عناصر سنگین غیر از نقره و شرایط کشت گیاه در طبیعت و کاملاً متفاوت با آزمایشات انجام شده است. ۴-۲ بررسی تاثیر نانونقره بر فاکتور های رویشی گیاه ۴-۲-۱ بررسی اثر نانو نقره در کاهش وزن تر و خشک گیاه تیمار نانو نقره بر رشد عمومی گیاه سیب زمینی و برخی شاخص های رشد گیاه اثر منفی نشان داد. همانطور که در فصل سه بیان شد بیشترین وزن تر و وزن خشک در نمونه های کنترل مشاهده شد و با افزایش غلظت نانو نقره، وزن تر وخشک نیز کاهش یافت. به طوریکه بیشترین کاهش وزن تر و وزن خشک در غلظت ۲ ppm نانو نقره مشاهده شد. وزن تر در غلظت ۲ ppm نانونقره حدود ۸۰% و وزن خشک حدود ۶۵% نسبت به شاهد کاهش نشان داد. به نظر می رسد که احتمالاً غلظت های ۱، ۵/۱ و ۲ ppm نانو نقره به عنوان یک فلز سنگین، علت کاهش وزن باشد. نه تنها وجود فلزات سنگین غیر ضروری بلکه غلظتهای زیاد عناصر ضروری هم موجب بروز علائم سمیت در گیاهان می شوند. وجود مقادیر سمی فلزات سنگین در محیط موجب کاهش رشد گیاهان و در حالت شدیدتر باعث از بین رفتن گیاهان می گردد. احتمالاً علائم به واسطه گسترده ای از روابط متقابل در سطح سلولی ملکولی باشد (Hall, 2002; Dietz et al., 1999). سمیت ممکن است ناشی از پیوند فلزات با گروه های سولفید ریل پروتئین ها باشد که مانع از فعالیت آنها می شود یا باعث تغییر و تخریب ساختمان آنها می گردد، یا در نتیجه جایگزینی فلز سمی به جای یک عنصر ضروری می باشد مانند جایگزینی کادمیوم به جای رو ی(Van ASche and Clijsters, 1990). علاوه بر این افزایش فلزات سنگین ممکن است تشکیل گونه های فعال اکسیژن را تحریک کند که نتیجه آن ایجاد استرس های اکسیداتیو است .(Dietz et al., 1999) این گروه از عناصر در گیاهان باعث کاهش رشد و کاهش بیوماس شده و باعث اختلافات فیزیولوژیکی و مورفولوژیکی در گیاهان می شود (Sharma et al., 2003). همچنین باعث کاهش تولید کلروفیل شده و بر روی ناحیه سطحی تیلاکوئیدها اثر می کنند و فعالیت آنزیم های زنجیره انتقال الکترون را مختل می کنند.(Mengel et al., 2001; Peralta et al., 2001) Hang وهمکاران (۲۰۰۵) برای بررسی اثر نانونقره بر تقسیم سلولی و شاخص های میتوزی از گیاه Allium استفاده کردند. برای این بررسی از مریستم های ریشه Allium که به مدت ۵/۰، ۱، ۲، ۴ ساعت در غلظت های ۱۰، ۲۰، ۴۰ و۵۰ppm نانونقره بود استفاده کردند. آنها یافتند که به صورت معنا داری شاخص میتوزی کاهش و انحراف ساختاری در کروموزوم افزایش یافت که این روند به مقدار و مدت زمان تیمار وابسته بود. شاید بتوان نتیجه گرفت که در گیاه سیب زمینی مورد مطالعه نیز چنین رخ دادی صورت گرفته است و یکی از دلایل کاهش وزن تر و خشک، شاخص میتوزی و افزایش انحرافات کروموزمی در گیاه باشد. به هر حال اظهار نظر در این مورد که آیا شاخص میتوزی تحت تاثیر نانو نقره قرار گرفته یا نه نیاز به مطالعات دقیق تری دارد. از جنبه ی دیگر می توان گفت که کاهش رشد مشاهده شده در غلظت های بالاتر نانونقره (۵/۱ و۲ ppm) احتمالا به دلیل آسیب های وارده در اثر سمیت غلظت های بالای نقره ویا احیانا تجمع ROS است.مشخص شده که ROS می توانند به آنزیم های سیکل تری کربوکسیلیک اسید(TCA) و زنجیره انتقال الکترون در میتوکندری مانند ATP سنتاز(کمپلکسN)، سوکسینات دی هیدروژناز(کمپلکسI)، اکونیتازو NADH دی هیدروژناز آسیب وارد کرده و آنها را مهار یا فعالیت شان را کاهش دهد(Verni quet et al۱۹۹۱;Sweet love et al۲۰۰۲). علاوه بر این مطالعات اخیر نشان داد که نانو نقره پس از ورود به سلول می تواند یون های Ag را ایجاد می کند(Lok et al. ,2007) که با ترکیبات سیتوپلاسمی و نوکلئیک اسیدها بر همکنش می دهد و آنزیم های زنجیره تنفسی را مهار می کند و در نفوذ پذیری غشا اختلال ایجاد می کند (Russell and hugo,1994; Park et al . ,2008).چنین اثراتی ممکن است دلیل دیگری برای کاهش رشد گیاه سیب زمینی در اثر تیمار نانو نقره در نظر گرفته شود. همچنین احتمال دارد با اثرات منفی سمیت غلظت های بالای نانونقره روی آنزیم های این مسیر ها در سلول گیاهی، تولید ATP در طول تنفس سلول در میتوکندری ها دستخوش تغییرات شده و این ممکن است بر روی فرایند های رشد و نموی گیاه اثر گذاشته و گیاه را با یک روند کاهش در رشد روبرو سازد. ۴-۲-۲ بررسی اثر نانو نقره در کاهش طول ریشه و ساقه نتایج حاصل از اندازه گیری طول ریشه و طول ساقه در شکل های ۳-۱-۳ و ۳-۱-۴ ارائه شده است. همانطور که در شکل نشان داده شده است بیشترین مقدار طول ریشه در محیط فاقد نانو نقره مشاهده شد و با افزایش غلظت نانو نقره در محیط کشت این شاخص به صورت معنی داری کاهش نشان داد بطوریکه در غلظت های ۵/۱ و ۲ ppm نانو نقره، با کاهش ۱۰۰درصدی رشد ریشه اتفاق افتاد. شاید این غلظت های نانو نقره برای گیاه بسیار سمی بوده است. نتایج نانو نقره بر طول ساقه تقریباً مشابه با اثر این ماده بر طول ریشه ی گیاه بود. به این ترتیب که افزایش غلظت نانو نقره موجب کاهش چشمگیر طول ساقه ی گیاهان تیمار گردید و در غلظت ۲ ppm نانو نقره، حدود ۹۳ درصد طول ساقه نسبت به شاهد کاهش نشان داد. همچنین اختلاف معنی داری بین غلظت های ۰ و ۵/۰ ppm نانو نقره مشاهده گردید. مطالعات نشان داده است که آسیب رساندن به ساختار غشاها، ایجاد کلروز و آسیب رساندن به ریشه ها یکی از اثرات فلزات سنگین در گیاهان است (Chatter jee et al., 2000). با توجه به اینکه نقره به عنوان یک فلز سنگین محسوب می شود. Lü و همکاران(۲۰۱۰) نشان دادند که دوام گل های رز(cv. Movie star)که در محلول های ۵۰ و ۱۰۰ میلی گرم بر لیتر نانونقره به مدت یک ساعت بوده اند به دلیل کاهش شکاف روزنه ای و کاهش در انتقال آب افزایش یافت. شاید بتوان نتیجه گرفت که نانونقره با ایجاد یون های نقره توانسته است بر روی تعرق و انتقال آب در گیاه اثر گذارد. همین کاهش تعرق و انتقال آب از توسعه ی ریشه در محیط کشت جلوگیری کرده است. مجدداً بایستی در نظر گرفت چنین اثری در کاهش رشد ریشه ی گیاه سیب زمینی در شرایط کشت در شیشه صورت گرفت و مطالعات انجام شده روی گل رز در شرایط طبیعی (in vivo) صورت گرفته است. ممکن است نانونقره( در این تحقیق مقدار نانو نقره در اندام های گیاه اندازه گیری نشد) به طور غیر مستقیم و از طریق مسیرهای سیگنالینگ با تاثیر و یا اختلال در روند دریافت برخی مواد، عناصر، متابولیت ها وغیره از برگ ها و اندام های هوایی به سوی ریشه، منجر به کاهش رشد و عدم توسعه ریشه و در نتیجه کاهش جذب مواد غذایی و عناصراز محیط کشت و کاهش رشد گیاه شده باشند. شاید یون های موجود در ریشه ها از طریق اختلال در جذب و یا انتقال برخی عناصر به بخش های هوایی اثرات سمیت خود را القا و منجر به کمبود این عناصر برای رشد گیاه گردند. این نتیجه در مورد برخی از فلزات سنگین دیگر نظیر کادمیوم مشاهده شده و مشخص گردیده که کادمیوم با مهار فعالیت آنریم Fe (III) ردوکتاز باعث کمبود Fe (II) و در نتیجه کاهش رشد در Cucomis sativs L. می گردد (Alcantara et al. ,1994). احتمال دارد چنین اثری در تیمار نانو نقره روی گیاه اعمال شده باشد. البته باید به این نکته توجه کرد که سمیت نقره در حالت نانو بیشتر از حالت نقره به صورت توده ای است(Musante and White,2010). برخی پژوهشگران با آزمایش بر روی گیاه Cucurbita pepo به این نتیجه رسیدند که نانو ذرات نقره ییوماس و تعرق را%۸۴-۶۶ کاهش داده است. آنها یافتند که غلظت یون های نقره در حالت نانو ۱۰-۴/۴ برابر بیشتر از محلول ذرات توده ای نقره است (Musante and White,2010). افزایش نسبت سطح به حجم نانو ذرات باعث می شود که اتم های واقع در سطح، اثر بسیار بیشتری نسبت به اتم های درون حجم ذرات، بر خواص فیزیکی ذرات داشته باشد. این ویژگی واکنش پذیری نانو ذرات را به شدت افزایش می دهد علاوه بر این افزایش سطح ذرات فشار سطحی را تغییر داده و منجر به تغییر فاصله بین ذرات یا فاصله بین اتم های ذرات می شود(Senjen ,2007). علاوه بر این مواد محلولی که اندازه ای کوچکتر از ۱۰۰nm دارند قابلیت حل پذیری بیشتری را نشان می دهند(Auffan et al. ,2009) و در نتیجه نفوذ پذیری و انتقال آن به سلول بیشتر خواهد شد. گیاهان با بهره گرفتن از دو نوع مکانیسم، پرهیز و تحمل در برابر سمیت یونهای فلزی مقاومت می کنند. (Baker, 1987). در مکانیسم پرهیز یا اجتناب ریشه ها به صورت موانعی برای حرکت فلزات سنگین در سیستم خاک – ریشه عمل می کند. ظرفیت دیواره های سلولی ریشه برای ایجاد پیوند با فلزات افزایشی می یابد. (Bakar et al., 2000) در مکانیسم تحمل گیاهان موجود در روی خاکهای فلزدار قادر به جلوگیری از جذب فلز به طور کامل نیستند و فلزات را در مقادیر بالا در بافتهای خود تجمع می دهند. با توجه به حساسیت گیاه سیب زمینی به نظر می رسد این گیاه نمی تواند از مکانیسم هایی که سایر گیاهان متحمل یامقاوم به فلزات سنگین استفاده می کنند رابه کار گیرد. بایستی توجه نمود که دلائل فوق بخشی از مسیر اثر نانو نقره بر کاهش رشد ریشه و ساقه است. از آنجائیکه در این پژوهش نانو نقره به عنوان یک عنصر ممانعت کننده ی فعالیت اتیلن مطرح است بنابراین بخش دیگری از دلائل کاهش رشد ریشه و ساقه را بایستی مرتبط با تلاقی این عنصر با فعالیت اتیلن و احتمالاً سایر هورمون های گیاهی مورد بحث قرار داد. ۴-۲-۳ بررسی اثر نانو نقره بر سطح برگ گیاه همانطور که در شکل ۳-۵ آمده است بیشترین سطح برگ در غلظت ۵/۰ppm نانو نقره مشاهده شد. در غلظت های ۱ و ۵/۱ppm نانو نقره نیز نسبت به کنترل افزایش سطح برگ مشاهده شد. ایجاد ریشه های هوایی، کاهش سطح برگ و منشعب شدن ساقه های گیاه از گیاهجه های سیب زمینی که در محیط کشت رشد می کنند فرآیندی است که بطور معمول رخ می دهد. این فرایند برای سایر گیاهان مانندBrassica compestris L. نیز گزارش شده است .(Lentini et al., 1988) در این امر حداقل بخش مهمی از آن به دلیل ایجاد اتیلن و کاهش مبادله ی گاز در محیط کشت رخ می دهد. اتیلن ، فراوانی ایجاد ساقه را در نمونه های گیاهی [۲۱] کاهش می دهد و باعث کند شدن رشد گیاه سیب زمینی در محیط کشت می شود(Chang and Chan, 1991) و از رشد کالوس های برنج نیز جلوگیری می کند(Adkins and Magdalita, 1994). Perl و همکاران(۱۹۹۸) گزارش دادند که اتیلن از تقسیم سلولی و تمایز زدایی سلولی در گیاهچه های کاهو جلوگیری می کند. در مطالعات مشابه روی گیاه سیب زمینی گزارش شده است که فعالیت اتیلن به کمک STS کاهش یافت و رشد سیب زمینی به سطح مناسب خود برگشت و برگ های بزرگتری که مناسب برای جداسازی پروتوپلاست بود ایجاد شد(Ehsanpour and Jones., 2001). با محاسباتی که برای معادل سازی غلظت نانو نقره با STS انجام شد نشان داد که تقریباً غلظت ۱ ppm نانو نقره غلظت مناسب برای افزایش سطح برگ گیاه سیب زمینی می باشد. با توجه به یافته های محققان و نتایجی که در پژوهش حاضر به دست آمد، شاید بتوان نتیجه گرفت که غلظت های ۵/۱ و ۲ میلی گرم در لیتر نانونقره در رشد سطح برگ گیاه سیب زمینی اثر سمی داشته است. البته با توجه به اینکه گیاه در غلظت ۵/۰ ppm نانونقره رشد گیاه از لحاظ سطح برگ، طول ساقه، ریشه های نابجا نسبت به شاهد در محیط کشت بهتر بود ولی از لحاظ طول ریشه وزن تر و وزن خشک اختلاف معنی داری نسبت به شاهد مشاهده نشد. بنابراین می توان گفت که این غلظت نانونقره توانسته است تا حدودی اثرات اتیلن را در محیط کشت کاهش دهد. اما با افزایش غلظت نانونقره اثر سمیت یونهای نقره برای گیاه بیشتر مشاهده شد. با توجه به اینکه بیشترین نسبت سطح برگ به طول ساقه در غلظت های ۱، ۵/۱ و ۲ ppm نانو نقره مشاهده شد شاید بتوان نتیجه گرفت که ارتباطی بین انرژی و فعالیتهای فیزیولوژیکی و متابولیکی بین طول ساقه و سطح برگ وجود دارد. با افزایش غلظت نانو نقره و مهار اثر اتیلن یا اثر سمی نقره طول ساقه کاهش شدیدی را نسبتبه گیاهان شاهد نشان داد. شاید این انرژی ذخیره شده در اثر کاهش تقسیم سلولی و طویل شدگی سلولی در طول ساقه صرف افزایش تقسیم سلولی و طویل شدگی سلولی و افزایش سطح برگ شده باشد. ۴-۳ بررسی اثر نانونقره بر کلروفیل گیاه کلروفیل نقشی یگانه و اثر گذار در زندگی گیاهان عالی دارد(Eckhavdt et al.,2994). از آنجا که محتویات کلروفیلی گیاه، یکی از پارامتر های شاخص عملکرد هورمون اتیلن است(Jona et al. ,1997). بررسی تاثیرات نانونقره بر میزان کلروفیل کل، به صورت غیر مستقیم از تاثیر اتیلن بر کلروفیل و فرایند فتوسنتز سخن می گوید. به طور کلی، در تحقیق حاضر با افزایش غلظت نانونقره در محیط کشت گیاه سیب زمینی رقم وایت دزیره، میزان کلروفیل a,b و کل اندازه گیری شده نسبت به حالت کنترل(محیط کشت MS بدون نانونقره)، تغییر معنی داری را نشان نداد. نتایج حاضر مشابه نتایجManios وهمکارانش (۲۰۰۳) بر گیاه Typha latifplia می باشد که اثر فلزات سنگینی چون کادمیوم، مس، نیکل، سرب و روی را بر غلظت کلروفیل بررسی کردند. آنها یافتند که غلظت های پایین فلزات سنگین اگرچه باعث افزایش غلظت این عناصر در ریشه می شوند، اما اثر معنی داری بر مقدار کلروفیل aوb می شود. سمیت فلزات سنگین برای متابولیسم گیاهی از طریق آزمایشات اثبات شده است(Markert, 1993). جانشینی یون۲+ Mg در ملکول کلروفیل با فلزات سمی مشخصی مانند مس، روی، کادمیوم یا جیوه در طی استرس های فلزات سنگین در گیاهان عالی نشان داده شده است که باعث تجزیه فتوسنتز می شود(Kupper et al. ,1996). Babu و همکاران(۲۰۱۰) نشان دادند که اضافه کردن فلزات سنگین کروم(۲۵، ۵۰ و۱۰۰ میکرومولار) و نقره(۵، ۱۰و ۱۵ میکرومولار) به سلول های سالم سیانوباکتریوم و اسپیرولینا پلاتنیس باعث دگرگونی در فعالیت زنجیره انتقال الکترون و فتوسیستم II می شود. نتایج نشان داد که یون های فلزات سنگین وابسته به غلظت بر روی انتقال الکترون در جایگاه های چند گانه اثر می گذارد و انتقال انرژی را تغییر می دهد. فلزات سنگین سمی هستند و گیاهان به راحتی آنها را تجمع می دهند. این فلزات سنگین از راه های گوناگون در انتقال الکترون فتوسنتزی دخالت می کنند(Kupper et al. ,2007; Mohanty and mohanty. ,1988). Babu و همکاران(۲۰۱۰) نشان دادند که مقدار مشخصی از یون های نقره (غلظت های بیش از۱۰µM) یک بازدارنده ی قوی در انتقال انرژی و انتقال الکترون در سیانوباکتر می باشد. به نظر می رسد نانو نقره در موارد فوق تغییری اعمال ننموده است. ممکن است میزان نقره ی موجود در غلظت های نقره مورد استفاده در این مطالعه، غلظت های چندان آسیب رسان به گونه ای که به طور جدی مانع از رشد گیاه گردند، نبوده و یا اینکه گیاه با فعال کردن سیستم های مختلف دفاعی خود توانسته خود را با شرایط محیطی سازگار سازد. احتمالاً مکانیسم های انتقال سیگنال از ریشه به اندام هوایی گیاه از طریق ترکیبات شیمیایی در غلظت های مختلف نقره می تواند تغییرات لازم را به دستگاه فتوسنتزی و رنگ دانه های آن اعمال کند. نتایج تحقیق حاضر نشان داد در غلظت های ۵/۰ و ۱ ppm نانو نقره سطح برگ افزایش یافت اما در میزان کلروفیل تغییری مشاهده نشد. احتمال آن می رود که با کوچکتر شدن سطح پهنک برگ در اثر سمیت نقره، به طور مستقیم یا غیر مستقیم در غلظت های ۵/۱ و ۲ ppm نانو نقره و در گیاهان شاهد، میزان کلروفیل در سلول ها تغلیظ یافته باشد و در نتیجه تفاوت معنی داری را نسبت به گیاهان تیمار نشده با نانو نقره نشان ندهد. ۴-۳ بررسی اثر نانو نقره بر میزان اسید جیبرلیک گیاه جیبرلین ها ترپنوئیدهایی هستند که حاوی ۲۰ کربن مشتق از ۴ واحد ایزوپرنوئیدی می باشند(تایز و زایگر، ۱۳۸۴). حداکثر مقدار جیبرلین در بذر وجود داشته و اغلب آن ها در همان محل ساخته می شوند. اما بافت های بذری، یکنواخت نبوده و محتوای جیبرلینی آن ها متفاوت است(تایز و زایگر، ۱۳۸۴). جیبرلین های جنین تولید آلفا آمیلاز را در بذر غلات تحریک می کند که به دلیل این است که اسید جیبرلیک نسخه برداری mRNA آلفا آمیلاز را افزایش می دهد(Tittle and Spencer, 1986). جیبرلین ها قابلیت توسعه ی دیواره ی سلولی را در ساقه ی گیاهان دارند. جیبرلین ممکن است با تغییر توزیع کلسیم در بافت، رشد را القاء کند. یون های کلسیم بر رشد هیپوکوتیل کاهو اثر بازدارندگی دارند و این ممانعت توسط GA3 خنثی می شود(Taiz and Zeiger, 2002).کلسیم به عنوان یک عامل کاهش دهنده ی قابلیت توسعه ی دیواره سلولی در دولپه ای ها شناخته شده است. در نتیجه ممکن است جیبرلین به نحوی غلظت کلسیم دیواره ی سلولی را کاهش دهد که این عمل احتمالاً با تحریک جذب کلسیم به داخل سلول صورت گیرد(تایز و زایگر، ۱۳۸۴). Al-Rumaih و همکاران(۲۰۰۱) اثر فلز سنگین کادمیوم را بر رشد گیاه Cow pea (Vigna unguiculata L.) بررسی کردند. آن ها مشاهده کردند که استفاده از فلز سنگین کادمیوم باعث کاهش رشد ریشه و ساقه(طول، وزن تر، وزن خشک و سطح برگ) می شود. اما با بهره گرفتن از جیبرلین همراه تیمار های کادمیوم، افزایش رشد ریشه و ساقه مشاهده شد. آن ها بیان کردند که این افزایش رشد شاید به دلیل افزایش نرخ فتوسنتز و ایجاد کربوهیدرات های مورد نیاز برای رشد مانند گلوکز باشد. همچنین مشاهده شد که سطح کربوهیدرات های ریشه و ساقه ی گیاه در تیمارهای کادمیوم و جیبرلیک اسید افزایش یافته است. به عبارت دیگر به خوبی مشخص شد که جیبرلین ها آنزیم های هیدرولیتیک که پلی ساکارید ها را در دیواره های سلولی هیدرولیز می کند و خاصیت ارتجاعی دیواره ی سلولی را باعث می شود القاء می کند. به علاوه بر تکثیر و طویل شدن سلولی اثر می گذارد(Daykin et al., 1997). به هر حال می توان گفت از آنجاییکه یون نقره نیز به عنوان یک فلز سنگین محسوب می شود شاید بتوان گفت اگرچه نقره یک ظرفیتی و کادمیوم فلز دو ظرفیتی است مانند کادمیوم عمل کرده و در تولید یا فعالیت جبرلیک اسید تداخل نشان داده است. همانطور که در بالا اشاره شد جیبرلین ممکن است با تغییر توزیع کلسیم در بافت، رشد را القاء کند. با اندازه گیری جیبرلین در گیاه سیب زمینی رقم وایت دزیره که تحت تیمار نانو نقره در غلظت های ۰، ۵/۰، ۱، ۵/۱ و ۲ میلی گرم در لیتر بودند مشاهده شد که با افزایش غلظت نانو نقره، طول ساقه ی گیاه کاهش یافت. Stewart و همکاران(۱۹۷۴) گزارش دادند که یک رابطه عکس بین جیبرلیک اسید و اتیلن در تنظیم طول میان گره در نشاء های نخود وجود دارد. با توجه به مطالعات انجام شده شاید بتوان به این نتیجه رسید که نانو نقره باعث مهار فعالیت اتیلن و در نتیجه افزایش مقدار جیبرلیک اسید می شود. از سویی دیگر بر پلی آمین ها و مسیر های سیکنالی کلسیم اثر می گذارد. جیبرلین در گیاه سنتز می شود اما این جبرلین نمی تواند وظیفه خود را در گیاه به دلیل بر هم خوردن سیگنال های کلسیمی اعمال کند و با افزایش تیمار نانو نقره، با اینکه مقدار جیبرلیک اسید افزایش می یابد اما طول ساقه کاهش شدیدی را نشان می دهد. مجموعه مواردی که بحث شد شاید بتواند دلائلی مبنی بر کاهش طول ساقه ی گیاهان سیب زمینی تحت تیمار نانو نقره را توضیح دهد. ۴-۴ تغییر پروتئین محلول کل در حضور نانو نقره حضور فلزات سنگین منجر به القاء تغییراتی در پروتئین ها در گیاه می گردد(Ewais, 1997). پروتئین ها محصولات نهایی مسیر های اطلاعاتی سلول هستند که در پاسخ به نیازهای سلول در شرایط مختلف ساخته شده و به موقعیت های سلولی مناسب منتقل و در صورت نیاز تخریب می گردد(کاکس و نلسون، ۱۳۸۲) و یا میزان بیانشان تغییر می یابد. به عنوان یک نتیجه ی کلی، تغییرات القاء شده در میزان پروتئین های محلول کل حاصل از جداکشت های بخش هوایی گیاهان سیب زمینی رقم وایت دزیره رشد یافته در محیط های دارای غلظت های به کار رفته نانو نقره و کنترل در غلظت های مختلف تغییر معنا داری مشاهده شد و به همین صورت الگوی متفاوتی در نحوه ی بیان در سطح ژل الکتروفورز مشاهده شد. متابولیسم پروتئین شامل سنتز پروتئین، فولدینگ و تعیین ساختمان پروتئینی، هدف دار کردن پروتئین ها و در نهایت تخریب آن ها می باشد(کاکس و نلسون، ۱۳۸۲). ترجمه ی کدهای ژنتیکی DNA که در ادامه ی همانند سازی ژنوم و رونویسی mRNA در سلول رخ می دهد، یک فرایند پیچیده ی بیوشیمیایی است که پیش سازهای آمینو اسیدی، فاکتورهای مختلف پروتئینی و آنزیم های مختلف و ماشین های ریبوزومی را درگیر می سازد،پروتئین های سنتز شده با توالی ها یا ساختارها و عملکردهای مختلف در سلول به واسطه ی تغییرات بعد از ترجمه در غشاء شبکه ی آندوپلاسمی مانند فسفریلاسیون و گلیکوزیلاسیون یا به واسطه ی داشتن توالی های خاصی، به سوی اندامک های سلولی و جایگاه های مورد نظر، هدف دار می گردند و به سوی اهداف خود هدایت می شوند. پروتئین های سالم در نهایت با اتمام طول عمرشان و پروتئین هایی که به صورت ناقص سنتز شده اند توسط سیستم های پروتئولیتیکی تخصصی در سلول ها تجزیه و تخریب می گردند، تمامی این فرایند در سلول با مصرف انرژی همراه است(کاکس و نلسون، ۱۳۸۲). شرکت اتیلن در فرایند های مختلف فیزیولوژیکی به طور قطع از طریق تاثیر پیام هورمونی اتیلن در هسته و روشن یا خاموش شدن ژن های فعال شرکت کننده در آن فرایندها و در نتیجه بروز پاسخ های اتیلنی در گیاه است. نانو نقره به عنوان یک بازدارنده ی فعالیت اتیلن، با مهار درک سیگنال اتیلن توسط گیرنده ها بر روند انجام این فرایندها و نحوه ی بیان ژن های درگیر در سطح رونویسی و ترجمه اثر می گذارد. می توان این نکته را در نظر داشت که حضور نانو نقره در محیط می تواند با تغییر در میزان بیان برخی پروتئین ها به صورت کاهش و یا افزایش بیان و یا حتی القاء مهار بیان آن ها، تغییراتی را در پروتئین کل سنجش شده صورت دهد. Krizkova و همکاران(۲۰۰۸) در بررسی اثر یون های نقره بر گیاهان آفتابگردان مشاهده کردند که میزان پروتئین کل با افزایش غلظت یون های نقره(mM 1-1/0) در ریشه کاهش می یابد. این محققین معتقدند که شاید این کاهش در پروتئین کل به دلیل انتقال پروتئین از ریشه به ساقه در ارتباط با آبشاری از فرایندها، در رابطه با پدیده ی فتوسنتز و نه به دلیل کاهش سنتز پروتئین در ریشه باشد. همچنین این محققان مشاهده کرده اند که فعالیت آنزیم اوره آز با افزایش غلظت یون نقره در گیاه افزایش یافته است. پروکاریوت ها و یوکاریوت ها در مقابل فلزات سنگین از خود دفاع می کنند. هر دوی این ارگانیسم ها راه های متعددی برای سمیت زدایی خود در مقابل فلزات سنگین به کار می برند. یکی از عمومی ترین راه ها، سنتز پپتیدها و پروتئین های غنی از سیستئین می باشد که این پپتید های سنتزی گیاهی فایتوکلاتین ها نام دارند(Clemens, 2006). بنابراین ممکن است بخشی از پروتئین های سنتز شده در اثر تیمار نانو نقره به واسطه ی سنتز فایتوکلایتین ها باشد. همانطور که می دانیم یکی از تغییرات بیوشیمیایی که در اثر ورود فلزات سنگین در گیاه ایجاد می شود تولید گونه های اکسیژنی فعال(ROS) مانند رادیکال های یونی سوپر اکسید(O2-)، پراکسید هیدروژن و رادیکال های هیدروکسیل (.OH) می باشد(Cho and Park, 2000). در نتیجه برای مقابله با این ترکیبات سمی، آنزیم هایی مانند سوپر اکسید دیسموتاز (SOD)، پراکسیداز(POX) و کاتالاز (CAT) نقش مهمی را بازی می کنند(Gupta et al., 1999). شاید بتوان گفت افزایش پروتئینی که در تیمارهای نانو نقره نسبت به کنترل، مشاهده شد در اثر تجمع گونه های فعال اکسیژنی و در راستای سازگار سازی گیاه نسبت به تغییر شرایط محیطی و به پیرو آن افزایش آنزیم ها و پروتئین های مقابله کننده با ROS های تولید شده باشد. بدیهی است اظهار نظر قطعی در این زمینه نیازمند مطالعات دقیق تر است. ۴-۵ تغییرات الگوی پروتئینی در حضور نانو نقره گیاهان با قرار گرفتن در معرض فلزات سنگین رنج عظیمی از پاسخ ها را در سطح مولکولی، سلولی و در سراسر گیاه می دهند، این پاسخ ها گه گاه با القاء تغییراتی در میزان بیان برخی ژن ها در گیاه، بر مسیرهای بیوشیمیایی و آنزیمی سلول، روند متابولیسم و در کل چرخه ی زندگی سلول و گیاه تاثیر می گذارند. بررسی تغییرات پروتئین ها و الگوی بیان آن ها در مواجه با فلزات سنگین می تواند در درک و شناسایی نقش آن ها در ایجاد ساز و کارهای سازشی و مقاومتی گیاه در آن تنش نقش مهمی داشته باشد. به منظور درک جنبه های مولکولی پاسخ گیاه سیب زمینی یون های نقره ایجاد شده از نانو نقره الگوی بیان پروتئینی گیاه در پاسخ به نانو نقره توسط SDS-PAGE مطالعه شد. البته از تاثیر یون های نقره(تیو سولفات نقره) بر روی بیان برخی پروتئین ها گزارشاتی در دست هست ((Rostami and Ehsanpour, 2009 همچنین تاثیر تیوسولفات نقره به صورت تنظیم مثبت یا منفی بر تغییر الگوی بیان برخی mRNAs و پروتئین های خاص مانند برخی پروتئین کینازها در ۴۰ میکرومولار تیوسولفات نقره(Ludwig et al., 2005) و تغییر بیان آنزیم های ACC اکسیداز در هایپو کوتیل آفتاب گردان(Liu et al., 1997) و… مطالعه شده است. در مطالعه ی حاضر نانو نقره منجر به ایجاد تغییراتی به صورت افزایش(در باند پروتئینی ۱ با وزنی بیشتر از ۱۱۶ کیلو دالتون و باند پروتئینی ۳ با وزنی کمتر از ۱۴ کیلو دالتون) و یا کاهش(در باند پروتئینی ۲ با وزنی حدود ۳۰ کیلو دالتون) در بیان برخی باند های پروتئینی گشت. این نتایج شواهدی را در سطح مولکولی مبنی بر القاء و یا تغییر بیان پروتئین های پاسخ دهنده به فلز سنگین به دست می دهد. تغییرات ایجاد شده ممکن است به دلیل آسیب های وارده به وسیله ی نقره و یا گونه های اکسیژن فعال در سطح ژنوم و بیان ژن ها(Blokhina et al., 2003) و یا پس از رونویسی و ترجمه به پروتئین ها و آنزیم باشد. افزایش بیان شده در باندهای پروتئینی ۱ و ۳ می تواند در اثر افزایش سرعت رونویسی و یا ترجمه، کاهش سرعت و میزان تخریب پروتئین های مسئول برای پاسخ به تغییرات رخ داده و افزایش طول عمر آن ها در سلول در پاسخ به تنش ها و تغییر شرایط محیطی باشد. کاهش بیان در باند پروتئینی ۲ احتمالاً می تواند ناشی از اثرات بازدارندگی نقره یا تنش اکسیداتیو پیرو آن بر روی رونویسی و یا فرایند ترجمه باشد. بیان متفاوت پروتئین های مختلف به صورت تنظیم مثبت و یا منفی مشخص می سازد که یک سیستم پیچیده ای برای پاسخ به تنش نقره(نانو نقره) در گیاه سیب زمینی وجود دارد. سلول های گیاه احتمالاً تحت شرایط استرس فلز سنگینی چون نقره، سنتز برخی پروتئین های ویژه ای را تغییر داده و این تغییرات اعمال شده در سنتز پروتئین ها متفاوت است. نتایج مشاهدات ما مشابه نتایجی است که از بررسی اثر STS بر روی گیاه سیب زمینی رقم وایت دزیره به دست آمده است(Rostami and Ehsanpour, 2009). با این تفاوت که این محققان در باند پروتئینی ۱۰۰ کیلو دالتون کاهش بیان پروتئین و در باندهای ۱۷، ۴۰ و ۵۰ کیلو دالتونی افزایش بیان پروتئینی را شاهد بودند. شاید این تفاوت به نوع ترکیب و یا غلظت نقره ی به کار رفته مربوط شود. به هر حال تغییر بیان برخی پروتئین ها که در شکل ۳-۵ مشاهده می شود می تواند مرتبط با تغییرات رشد و نموی از جمله افزایش سطح برگ، کاهش طول ساقه و ریشه در اثر تیمار با نانو نقره باشد. ۴-۶ بررسی تاثیر نانو نقره بر تعداد و قدر ت زیست پروتوپلاست تعداد و قدرت زیست پروتوپلاست های جداسازی شده ی گیاهان به شرایط فیزیولوژیکی و ژنوتیپ آن ها وابسته است(Fish et al., 1987). آزمایشات با تیوسولفات نقره بر جداسازی پروتوپلاست نشان داده است که استفاده از نمک نقره به دلیل مهار ساخت یا فعالیت اتیلن باعث افزایش تعداد پروتوپلاست ها و همچنین افزایش قدرت زیست پروتوپلاست گیاهان سیب زمینی در مقابل گیاهان شاهد می باشد. با مهار فعالیت اتیلن سطح برگ افزایش می یابد و بافت مزوفیلی مناسب تری برای جداسازی پروتوپلاست به دست می آید(Ehsanpour and Jones., 2001). در این تحقیق از آنزیم پکتیناز R-10 برای برای جدا کردن سلول های مزوفیل از یکدیگر و سلولاز R-10 برای حذف دیواره ی سلولی استفاده شد. فاکتور های زیادی در جداسازی پروتوپلاست نقش دارد مانند ضخامت دیواره ی سلولی، دما، مدت زمان قرار گیری در آنزیم، pH مناسب، حرکت دادن ملایم ظرف حاوی بافت گیاهی و آنزیم و نوع ماده ی اسموتیک(Davey et al., 2005). برای جداسازی نیاز به نمک ها و یا قند های الکلی محلول مانند سوربیتول ۱۳% و یا مانیتول ۵% مولار نیاز است که آسیب به سیتوپلاسم را کاهش می دهد(Ortin-Parraga and Burgos, 2003). یکی از مکانیسم های مقاومت به فلزات سنگین، کاهش جذب و تجمع فلزات سنگین توسط دیواره ی سلولی و غشاء پلاسمایی است. در غلظت های کم فلزات سنگین(Wang et al., 2010) فقط بخشی از کل یون های همراه شده با ریشه، به درون سلول ها جذب می شوند. از آنجاییکه این یون ها به طور فیزیکی در مناطق باردار منفی خارج سلولی(Coo-) در دیواره ی سلول های ریشه جذب سطحی می شوند، این ذرات باند شده به دیواره ی سلولی به قسمت های هوایی گیاه منتقل نمی شوند، بنابراین گیاه عمدتاً تجمع قابل توجهی از فلز را در ریشه نشان می دهد(Blaylock and Huang, 1999). Wang و همکاران(۲۰۱۰) با بررسی اثر فلز سنگین تربیوم بر روی ترب کوهی دو پیشنهاد در مورد جذب فلزات سنگین می دهند. یکی اینکه تربیوم نمی تواند به سیتوپلاسم گیاه وارد شود و تنها در پروتوپلاسم، دیواره ی سلولی یا بخش خارجی غشاء پلاسمایی قرار می گیرد(Wei,2001) و یا اینکه این فلز می تواند وارد سلول گیاهی شود و در نهایت با غشاء پروتوپلاسم، کلروپلاست، میتوکندری، سیتوپلاسم و واکوئل در سلول های گیاهی باند شود(Li et al., 2008). این تفاوت وابسته به گونه های گیاهی، شرایط آزمایش، روش های اندازه گیری و شرایط فلزات سنگین می باشد. به عنوان مثال در مورد تربیوم گزارش شده است که چه در مقدار کم(۵ میلی گرم در لیتر) و چه در مقدار زیاد(۶۰ میلی گرم در لیتر) غشاء پلاسمایی از بین می رود. نتایج مشاهدات ما از بررسی نانو نقره بر تعداد و قدرت زیست پروتوپلاست گیاه سیب زمینی به این صورت بود که تیمار نانو نقره منجر به کاهش تعداد پروتوپلاست و قدرت زیست پروتوپلاست های جداسازی شده و این امر با افزایش غلظت نانو نقره، کاهش معنی داری را نشان می دهد. از آنجاییکه تا کنون گزارشی در مورد اثر نانو نقره بر پروتوپلاست دیده نشده است، با توجه به نتایجی که محققان از بررسی فلزات سنگین دیگر بر روی سلول به دست آورده اند شاید بتوان دو پیشنهاد برای کاهش تعداد و قدرت زیست پروتوپلاست گیاه سیب زمینی ارائه داد. اول اینکه احتمالاً تنش یون های نقره بر روی ضخیم شدن دیواره ی سلولی اثر گذاشته است. همانطور که قبلاً اشاره شد یون های نقره می توانند با مناطق باردار منفی خارج سلولی(Coo-) در دیواره ی سلول ها واکنش داده(Blaylock and Huang, 1999) و به نحوی باعث ضخیم شدن دیواره ی سلولی شود. این پیشنهاد مشابه نتایجی است که Krizkova و همکاران(۲۰۰۸) با بررسی یون های نقره بر روی گیاهان آفتابگردان به دست آورده اند. این محققان بیان می کنند که تیمار نقره(mM 1 و ۵/۰ ،۱/۰)به مدت ۹۶ ساعت تغییرات ساختاری مهمی را در ریشه و سافه ی گیاه القاء می کند. از جمله اینکه دیواره ی ثانویه ضخیم می شود، مغز پارانشیم در مرکز ریشه توسعه می یابد، فلوئم در دستجات آوندی کاهش می یابد و دیواره های سلولی چوبی می شوند. دومین پیشنهادی که می توان در این زمینه ارائه داد این است که شاید سلول به طور کلی آسیب دیده است. غشاء پلاسمایی دارای اجزایی با بار منفی می باشد که به خصوص می توان به پروتئین ها اشاره کرد(Lodish, 2003). این پروتئین ها(ATPase, Calmodolin, Ca- binding protein) که در برخورد با فلزات سنگینی همچون تربیوم(Wang et al., 2010) به شدت آسیب می بیند. قدرت برهم کنش بین پروتئین ها و یون های فلزی سنگین به غلظت یون فلزی بستگی دارد(Wang et al., 2010). در غلظت پائین فلز سنگین(۵ میلی گرم در لیتر) این یون فلزی با پروتئین های غشاء برهمکنش می دهد و فعالیت این پروتئین ها کاهش می یابد(Wang et al., 2009). این کاهش فعالیت منجر به بر هم خوردن تعادل بین تولید و از بین رفتن رادیکال های آزاد می شود(Ahmad et al., 2008). افزایش رادیکال های آزادباعث افزایش اکسیداسیون اسید های چرب غیر اشباع غشاء می شود(Roozen et al., 1994). که این امر باعث پراکسیده شدن لیپید های غشاء می شود(Wang et al., 2009).همچنین در غلظت های بالای یون فلز سنگین، این یون توانایی وارد شدن به سلول و ایجاد OH را دارد که این امر منجر به اختلال در تولید میکروتوبول و میکروفلامنت می شود(Liu and Hasenstein, 2005) که در نهایت این یون فلز سنگین باعث آسیب به ساختار سلولی، غشاء سلولی، سیتواسکلتون، اندامک ها و پروتوپلاست سلولی می شود. این آسیب ها با افزایش غلظت یون فلز سنگین تشدید می شود چراکه پراکسیده شدن لیپید های غشاء افزایش می یابد(Wang et al., 2010).