وبلاگ

تصویر ۳-۳ اسفنج خیس شده در حلال و فاز میانی ایجاد شده
تصویر۳-۴ محلول عصاره گیری بعد از فیلتر کردن با کاغذ صافی واتمن شماره ۱
تصویر ۳-۵ دستگاه روتاری Heidolph مدل Laboreta 4011digital
تصویر۳-۶ عصاره اسفنچ بعد از تبخیر حلال با بهره گرفتن از دستگاه روتاری
۳-۳-۲ تهیه عصاره الکلیاسفنج
نمونه اسفنجی را که در الکل نگهداری شده بود از الکل خارج کرده در محیط آزمایشگاه برکاغذ صافی تمیز قرار داده تا الکل آن تبخیر شود سپس چندین مرتبه با سرم فیزیولوژی استریل شستشو داده و دوباره تا خشک شدن آن صبر کرده اسفنج را به قطعات ریزی در آورده در بطری شیشه ای درب دار قرار داده سپس نسبت حجم ۱ : ۱ از حلال ها را روی آن ریخته (حجم ۱۵ میلی لیتر متانول و ۱۵ میلی لیتر دی کلرومتان برای ۵۰ گرم اسفنج بعد از تبخیر الکل) درب بطری را محکم بسته و به مدت ۲۴ ساعت در محلی تاریک دور از گرما قرار داده بعد از گذشت ۲۴ساعت سه فاز حلال بدست آمده بود بطری را چند مرتبه به آرامی هم زده و سپس قطعات اسفنج را فشرده و از بطری خارج می کنیم محلول را جهت حذف رسوبات اضافی با بهره گرفتن از کاغذ صافی شماره ۱ واتمن فیلتر کرده محلول بدست آمده با بهره گرفتن از دستگاه روتاریحلال اضافیرا حذف کرده۱۰ میلی لیتر حجم نهایی عصاره بدست آمدهبا حرف لاتین E نام گذاری شد. عصاره بدست آمده در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری شد(Palpandi et al., 2012).

۳-۲-۳تهیه عصاره اسفنج منجمد
اسفنج منجمد در فریز ۸۰- روی کاغذ صافی تمیز قرار داده تا یخ آن ذوب شود سپس با سرم فیزیولوژی استریل شسته دوباره تا خشک شدن آب آن صبر کرده اسفنج را به قطعات ریز در آورده و نسبت حجم ۱:۱ حلال (Newbold et al., 1999) روی آن ریخته و مانند مراحل بند فوق ادامه می دهیم
۳-۳ تهیه میکروب و قارچ های بیماری زای انسان
جهت انجام این پروژه سعی شده از میکروب و قارچ های بیماری زای انسان استفاده گردد، میکروب ها از آزمایشگاه میکروبیولوژی بیمارستان ولی عصر خرمشهر شاملباکتری گرم منفی اشریشاکلای^[۴]، باکتری های گرم مثبت استافیلوکوک اورئوس^[۵]، گونه شیگلا^[۶] (تصاویر ۳-۷،۳ -۸ و۳-۹) بوده است. نمونه های قارچ از بخش قارچ شناسی دانشگاه جندی شاپور اهوازشامل آسپرژیلوس فلاوئوس^[۷]،پنی سیلیوم^[۸] و مخمر کاندیدا آلبیکنس^[۹]تهیه گردید.

تصویر۳-۷محیط کشت استافیلوکوکوس اورئوس
تصویر ۳-۸ محیط کشت اشریشاکلای
تصویر ۳-۹ محیط کشت شیگلا
۳-۴کشت میکروب و قارچ
بعداز انتقال میکروب و قارچ ها به آزمایشگاه میکروبیولوژی دانشگاه در محیط کشت تازه (میکروب در نوترینت آگار^[۱۰] و قارچ در ساب دکستروزآگار^[۱۱])کشت داده شدند.دمای انکوباتور جهت رشد میکروب ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۲۴ تا ۴۸ ساعت و برای قارچ ۳۰درجه سانتی گرادبه مدت ۲۴تا ۷۲ ساعت می باشد (Darah et al., 2011).
۳-۵ استخراج DNAو شناسایی مولکولی اسفنج گونه callyspongia sp.
۳-۵-۱ استخراجDNA
مقدار ۸۰ تا ۱۰۰ گرم ازنمونه اسفنجی که در الکل نگهداری شده بود را بر فویل آلومینیومی استریل قرار داده بعداز تبخیر الکل آن در هاون چینی آزمایشگاهی استریل با کمی نیتروژن مایع پودر کرده (تصویر شماره ۳-۱۰ )سپس پودر اسفنج را در میکروتیوب ریخته مقدار ۶۳۰ میکرولیتر محلول۱%^[۱۲]CTAB(در دمای ۶۰ درجه سانتی گراد بن ماری گرم شده)بر آن ریختهسپس ۷۰ میکرولیتر۲%^[۱۳]SDS (pH برابر۸)و۵تا۷ میکرولیتر پروتئیناز K^[14]به آن افزودهوبه مدت یک شب در بن ماری ۵۵ درجه سانتی گراد قرار داده شد.درمرحله بعدی استخراج DNA میکروتیوب ها را از بن ماری خارج کرده ۲۴۰ میکرولیتر محلول نمک طعام ۵/۱ مولار، ۲ میکرولیتر بتا کاپتواتانول(Kennedy et al., 2008)به آن اضافه کرده و برای تسهیل لیز شدن بافت اسفنجی میکروتیوب ها را در بن ماری ۳۷ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه گذاشته، در مرحله بعد ۲۵۰ میکرولیتر کلروفورم (زیر هود اضافه می شود) اضافه کرده و۱۵ دقیقه در ۱۲۰۰۰ دور و دمای ۴ درجه سانتی گراد سانتریفیوژمی شوند et al.,2008). (Kennedy.
تصویر ۳-۱۰ اسفنج پودر شده با بهره گرفتن از نیتروژن مایع
در مرحله بعد فاز بالایی را به آرامی با سمپلر استریل جدا کردهدر میکروتیوب جدید ریخته و ۷۰۰ ماکرولیتر ایزوپروپانول (از قبل در فریز بوده است) اضافه کرده به آرامی میکرو تیوب ها را سر و ته کرده و مجددا در ۱۲۰۰۰ دور دمای ۴ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه سانتریفیوژ کرده رسوب سفید رنگ ته نشین شده توده DNA می باشد.ایزوپروپانول را به آرامی ریخته، در هوای اتاق ۳ تا ۴ دقیقه قرار داده سپس مقدار ۵۰۰ ماکرولیتر الکل ۷۰ درصد با ۸۰۰۰دور، دمای ۴ درجه سانتی گرادبه مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژکردهفاز رویی را خالی کرده و برای تبخیر الکل به مدت ۳۰ دقیقه میکروتیوب را در مکان تمیز در آزمایشگاه قرار داده سپس ۵۰ تا ۱۰۰ میکرولیتر آب مقطر استریل درون میکروتیوب ریخته و در یخچال نگهداری شد (Kennedy et al.,2008).
۳-۵-۲ بررسی کیفیتDNA
جهت اطمینان از بدست آمدنDNA مطلوب محلول نهایی فوق از ژل آگاروزراناستفاده کردهبه این صورت که ۳/۰ گرم آگاروز را با ۳۰ میلی لیتر محلول TE ^[۱۵]حل کرده،بعد از ژله ای شدن، DNA را با سمپلر استریل درون چاهک ها تزریق کرده سپسبا استفاده از دستگاه الکتروفوروز افقی با ولتاژ ۷۵ به مدت ۴۰ دقیقه این عمل انجام گرفت.
۳-۵-۳ PCR
مواد PCR عبارت اند ازµ۵/۰dNTPs ، بافرµ۵/۲(^[۱۶]Tris،KCL ،pH 8/4 )، µ۱MgC، پرایمرهاµ۱،Taq DNA پلیمراز µ۳/۰و رشته های الگو CMT-^[17] µ۱٫ دمای موثر در فرآیندPCR 50 درجه سانتی گراد بوده است (Kennedy et al.,2008). بعد از بارگذاریمحصول PCR بر ژل آگاروز مقدار باندهای بدست آمده را با بهره گرفتن از مارکر DNA Ladder1Kb –RTUمقایسه گردید)تصویر ۳-۱۳ ).
۳-۶سنجش میکروبی
۳-۶-۱آزمون حساسیت آنتی بیوتیک کربی بایر^[۱۸]
آزمون کربی بایر سنجش حساسیت باکتری نسبت به رقت های مختلف آنتی بیوتیک استبه این صورت که دیسک های آغشته به آنتی بیوتیک را بر محیط کشت باکتری قرار می دهند در اطراف دیسک باکتری رشد نمی کند قطراطراف دیسک را منطقه ی مهاری رشد می نامند. اندازه قطر این منطقه بستگی به میزان اثر آنتی بیوتیک بر رشد آن باکتری دارد.هرچه آنتی بیوتیک اثر قویتری داشته باشد منطقه مهاری بزرگتری ایجاد می گردد.غلظت آنتی بیوتیک با دور شدن از دیسک کمتر می شود در نتیجه مقدار کلنی ها نزدیک تر کمتر یا بدون هیچ کلنی می باشد از این برآورد برای میزان انتشار اثر آنتی بیوتیک استفاده می شود(Johnson et al.,2012).
مواد ضدباکتری به دو دسته موادباکتریواستاتیکی^[۱۹] یا مهارگر باکتری و باکتریوسیدالی^[۲۰] یا مواد کشندهباکتری تقسیم می شوند.باکتریواستاتیک به هر ماده ای که می تواند رشد باکتریها را متوقف واز تقسیم باکتری جلوگیری کند، باکتریوسیدال به موادی که قابلیت نابود سازی مستقیم باکتری را داشته باشد می گویند.
۳-۶-۲ بررسی اثر ضد میکروبی عصاره اسفنج . Callyslpongia sp خشک شده
جهت سنجش اثر ضد میکروبی عصاره اسفنج، ابتدا محیط کشت مولر هینتون آگار تهیه شد سپس هریک از میکروب ها به روش خطی کشت داده شدند و مقدار ۲۰ میکرولیتر از عصاره Dبر دیسک دیفیوژن بلانک ۶ میلی متری ریخته با پنس استریل به آرامی روی محیط کشت درنقاط مختلف قرار داده، برای کنترل منفی از حلال هایی که عصاره از آن تهیه شده بود استفاده گردید و برای کنترل مثبت دیسک آنتی بیوگرام نیتروفلوستاتین و جنتامایسین به کار رفت.قطر هاله عدم رشد باکتریبا استفاده از خطکش میلی متری اندازه گیری شد (et al.,2011. Darah).
۳-۷-۳بررسی اثر ضد میکروبی عصارهالکلی اسفنج Callyslpongia sp.
کشت میکروب و کنترل منفی و مثبت مانند بندفوق) ۳-۶-۲) انجام شد و قطر هاله ایجاد شده با بهره گرفتن از خط کش میلی متریاندازه گیری شد.
۳-۶-۴بررسی اثر ضد میکروبی عصاره اسفنج منجمد شده Callyslpongia sp.
کشت میکروب و کنترل منفی و مثبت مانند فوق) ۳-۶-۲) انجام شد و قطر هاله ایجاد شدهبا استفاده از خط کش میلی متریاندازه گیری شد.
۳-۶-۵(MinimumInihibitory Concentration)MICو )MBC(Minimum BacteriaConcentration
MIC(MinimumInihibitory Concentration)حداقل غلظت مهاری یا غلظتی از آنتی بیوتیک است که می تواند رشد باکتری را در شرایط آزمایشگاهی مهار کند(Subramani et al.,2013). در این تحقیق سه رقت از عصاره تهیه شد و هریک در محیط کشت مایع نوترینت براث^[۲۱] بر میکروب ها تلقیح شد، بعد از ۲۴ ساعت انکوباسیون کدورت محیطکشت ها با دستگاه اسپکتروفتومتری اندازه گیری شد.
MBC(Minimum BacteriaConcentration) حداقل غلظت باکتری یا حداقل تعداد کلنی باکتری می باشد.اگرهریک ازMIC بر محیط کشت مولر هینتون آگار^[۲۲]کشت داده شود تعداد کلنی ایجاد شده را شمارش کرده مقدار MBC به دست خواهد آمد. نسبتMIC به MBC شاخص باکتریواستاتیک به باکتریوسیدال می باشد(Johnson et al.,2012).
۳-۷کدورت سنجی محیط کشت میکروبی مایع
۳-۷-۱تهیه سوسپانسیون میکروبی ۵/۰ مک فارلند^[۲۳]
مقدار ۱۷۵/۱ گرم کلرید باریم را در ۱۰۰ سی سی آب مقطر حل کرده در ارلن دیگر اسید سولفوریک ۱% تهیه کرده سپس ۵/۰ سی سی محلول کلرید باریم را به ۵/۹۹ سی سی اسید سولفوریک ۱%اضافهکرده حجم نهایی را به ۱۰۰ سی سی رسانده، محلول بدست آمده کدر همان کدورت ۵/۰ مک فارلند معادل کدورت ×۱ باکتری می باشد(Darah et al.,2011).
درتصویر ۳-۱۸ لوله آزمایش سمت راست حاوی سوسپانسیون میکروبی، لوله سمت چپ محلول ۵/۰ مک فارلند ولوله وسط آب مقطر به عنوان شاهد می باشد.
تصویر ۳-۱۱ مقایسه محلول های میکروبی ۵/۰ مک فارلند و کلرید باریم
۳-۸-۱رقت مهار کننده های رشد میکروبی
در زیست شناسی و پزشکی رقت به منظور کاهشغلظت موجودات زنده ی میکروسکوپی یا تعداد سلول های نمونه مورد استفاده قرار می گیرد .به عنوان مثال تعداد و اندازه ی کلنی باکتری ها در پلیت آگار در یک زمان معین رشد وابسته به غلظت آنهاست بیان مقدار حداقل غلظتی که می تواند اثر مهار کنندگی رشد میکروبی را داشته باشداست (http://en.wikipe dia.org/wiki/serial_dilution).
۳-۸-۲دستگاه اسکتروفتومتری
دستگاه اسپکتروفتومتری جهت سنجش مقادیر کدرورت محلول ها می باشد.هر ترکیب در محدوه ی خاصی از طول موج نور راعبور می دهد.این محدوه تجربی بدست می آید.اسپکتروفتومتری اندازه گیری جذب یا انتقال نور توسط ماده شیمیایی می باشد .اگر نمونه هیچ نوری را جذب نکند یعنی تمام نور را عبور داده در این صورت نمونه روشن به نظر می رسد و اگر نمونه تمام نور را جذب کند و هیچ نوری را عبور ندهد نمونه تیره می باشد.طیف سنج مرئی را در محدوه ی ماورابنفش(۴۰۰-۱۸۵ نانومتر)و در محدوه ی (۷۰۰-۴۰۰نانومتر) از اسپکتوفتومتری الکترومغناطیسی قابل مشاهده است .در طیف سنج IRمحدوده ی ۷۰۰-۱۵۰۰ نانومتر اسپکتوفتومتری مادون قرمز قابل مشاهده است .نمونه های آزمایشگاهی در این تحقیق با طیف ۶۱۰نانومتر سنجیده شد (Said et al., 2010).
در این تحقیق اندازه گیری مقدار کدورت محیط های کشت میکروبی بعداز اضافه عصاره به آن می باشد به این صورت که مقداری از محیط کشت انکوباته شده را در جایگاه نمونه قرار داده نور از آن جایگاه عبور کرده و برحسب روشنی و تیرگی آن،جذب نمونه می شود بقیه نوری که از نمونه عبور می کند با بهره گرفتن از فرمول زیر محاسبه می شود.
(۳-۱)
IT مقدار نوری است که از جایگاه نمونه عبور می کند.
مقدار نوری است که بعد از جذب از نمونه عبور می کند.
مقدار جذب نور از فرمول زیر محاسبه می شود
A نور جذب شده توسط نمونه