وبلاگ

شکل۳-۴ دستگاه مولد ولتاژ و تانک الکتروفورز
۱۲- شیکرانکوباتور ساخت (شکل ۳-۵ )
شکل ۳-۵ شیکر انکو باتور
۱۴- سانتریفیوژ ساخت شرکت اپندور آلمان (شکل ۳-۶ )
شکل ۳-۶ سانتریفیوژ
۱۴- گرماساز^[۴۰]
۱۶- دستگاه تصویر ساز ژل^[۴۱] ( شکل۳-۷)
شکل۳-۷ دستگاه تصویر ساز ژل
۱۷- انکی باتور شانزده درجه ( شکل ۳-۸ )
شکل۳-۸ انکی باتور شانزده درجه
۱۸- بن ماری (شکل ۳-۹ )
شکل۳-۹ بن ماری
۱۹٫سانتریفیوژ یخچال دار
۳-۲ آنالیز بیوانفورماتیکی ناحیه C2 پروتئیینALCAM
۳-۲-۱ استخراج توالی ناحیه C2 پروتئیین ALCAM
توالی مورد نظر از طریق سایت های Swiss-port / Uniprot KB و مرکز ملی اطلاعات بیوتکنولوژی^[۴۲] (NCBI) بدست آورده شد. سپس در انتهای ۳’ توالی مورد نظر ، ۶ اسید آمینه ی هیستیدین (His-Tag ) قرار داده شد و کدون پایان (TAA ) هم بعد از آن قرار گرفت. در انتها نیز جایگاه های برش آنزیمی برای آنزیم های محدود کننده NcoI در سر ‘۵ توالی و جایگاه برش آنزیمی برای آنزیم محدود کننده XhoI در سر ‘۳ توالی قرار داده شد.

۳-۲-۲ بهینه سازی یا Optimization توالی ناحیه C2 پروتئیینALCAM
از آنجای که ثابت شده فرایند گلیکوزیلاسیون به نحوه اتصال این پروتئین در واکنش های هموفیلیک تاثیری ندارد میزبان پروکاریوتی E.coli برای فرایند کلونینگ انتخاب شد. برای دستیابی به بیشترین میزان بیان صحیح در E.coli توالی ۷۹۲ نوکلئوتیدی ناحیه C2 پروتئیینALCAM طراحی شده توسط شرکت Genscript ایالات متحده آمریکا بهینه سازی شد.
پارامترهایی که توسط این شرکت برای فرایند بهینه سازی در نظر گرفته شد، شامل موارد زیر می شود :
codon usage میزبان
محتوای CG
ساختار دوم mRNA پیش بینی شده .
از بین بردن نواحی برش ناخواسته .
جایگاه های آنزیمی آنزیم های محدودالاثر که ممکن است در فرایند کلونینگ اختلال ایجاد کنند.
۶٫به حداقل رساندن نواحی تکرار شونده مستقیم یا غیر مستقیم.
۳-۳ سنتز شیمیایی DNA ناحیه C2 پروتئین ALCAM
۳-۳-۱ سنتز شیمیایی ژن نوترکیب
توالی طراحی شده ناحیه C2 پروتئین ALCAM توسط شرکت Biomatik کانادا بصورت شیمیایی سنتز شد و درون وکتور pBSK قرار داده شد.
۳-۳-۲ پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده
DNA لیوفیلیزه شده را می توان توسط بافر TE استریل یا آب بدون نوکلئاز در PH طبیعی و با توجه به امکانات محیط آزمایشگاه بصورت محلول در آورد. و سپس می توان آن را در دمای بین۲۰- تا ۸۰- درجه سانتیگراد برای مدت طولانی نگهداری کرد. DNA لیوفیلیزه شده، محلول شده به کمک بافر TE می تواند به مدت ۶ ماه در دمای ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شود در صورتی که اگر از آب برای محلول سازی استفاده شود امکان نگهداری در ۴ درجه سانتیگراد وجود ندارد.
۳-۳-۳ محلول سازی DNA لیوفیلیزه
قبل از باز کردن تیوب حاوی DNA ، ابتدا بهتر است به مدت چند ثانیه تیوب را سانتریفیوژ کنیم تا DNA های متصل به دیواره جدا شوند. در صورت عدم سانتریفیوژ ممکن است مقداری از ذخیره­ی DNA در هنگام برداشتن آن به دیواره های سر سمپلر بچسبد و از دسترس خارج شود.
۱٫استوک اصلی: µg 10 از DNA لیوفیلیزه در µl 100 از بافر TE حل شد.

2. 2. استوک مورد استفاده: در یک میکروتیوب دیگرµl 1 از استوک اصلی در µl10 از بافر TE حل شد. ( غلظت نهایی به ng/ µl10 رسید.)

۳-۴ کلونینگ پلاسمید- AMP⁺ pBSK حاوی DNA ناحیهC2پروتئین ALCAM
۳-۴-۱ آماده سازی باکتری شایسته
جهت آماده سازی باکتری Top 10 برای پذیرش پلاسمید ابتدا باید آن را کامپتنت یا شایسته سازی کرد.
۳-۴-۱-۱ مواد و محلول ها
- محلول کلرید کلسیم ۰٫۱ مولار
- LB براث بدون آنتی بیوتیک
- LB براث حاوی آمپی سیلین ( پس از ساختن براث و سپس سرد شدن آن بعد از اتوکلاو کردن، آمپی سیلین به محیط کشت افزوده شد. غلظت آمپی سیلین باید حدود ۱۰۰ میکروگرم در هر میلی لیتر باشد )
- LB آگار حاوی آمپی سیلین ( روش تهیه دقیقا مشابه LB براث است ).
۳-۴-۱-۲ روش کار
باکتری را در محیط کشت فاقد آمپی سیلین کشت داده.
۲- برای مدت۲۴ ساعت (over night) محیط کشت را در انکوباتور قرار داده، یک تک کلون از آن را انتخاب کرده و به ۵ میلی لیتر محیط LB مایع بدون آمپی سیلین تلقیح می کنیم و سپس به مدت یک شب تا صبح در شکیرانکوباتور قرار می دهیم تا باکتری رشد کنند.
۳- ۴۰۰ میکرو لیتر از محیط فوق را به ۵ میلی لیتر محیط LB براث تازه تلقیح نموده و مجددا آن را به مدت ۲تا ۳ ساعت در شیکرانکوباتور قرار می دهیم. تا محیط کدورت مناسب یعنی جذب ۵/۰ تا ۸/۰ در۵۰۰ نانومتر را به ما می دهد در این حالت باکتری در فاز رشد لگاریتمی خود قرار دارد.
۴- باکتری هایی که به این طریق تازه گشته و در فاز لگاریتمی تکثیر می باشند را در چند میکروتیوب استریل توزیع کرده و ۵ الی ۱۰ دقیقه روی یخ نگه می داریم.