وبلاگ

۳-۶-۲. تهیه سوسپانسیون باکتری
ابتدا ۱۰-۸ کلونی از باکتری­ ها برداشته ­شد و به شیشه­های کوچک در پیچ دار حاوی ۲ میلی لیتر سرم فیزیولوژی یا آب مقطر استریل اضافه ­گردید. ۱۰-۸ عدد گویچه شیشه ­ای (pearls) به ظرف­ها اضافه ­شد و به مدت ۵-۴ دقیقه با بهره گرفتن از شیکر، سوسپانسیون­ها یکنواخت ­گشتند. سپس به کمک سمپلر از روی سوسپانسیون­ها برداشته و به لوله حاوی ۱cc آب مقطر تا حدی اضافه گردید تا کدورت آن به یک مک فارلند ­رسید. از سوسپانسیون حاضر رقت­های،و تهیه ­گردید. ۲۰۰µlit به هر یک از محیط­های حاوی آنتی بیوتیک­ها و محیط شاهد فاقد آنتی­بیوتیک اضافه گردید. پس از افزودن سوسپانسیون لوله­ها به آرامی تکان داده شد بطوریکه سوسپانسیون با تمام محیط تماس داشته پیدا ­کرد.
۳-۷. کشت سویه­های انتخابی در محیط میدل بروک ۷H9
این محیط یکی از محیط­های مایع و اختصاصی برای رشد خالص جهت کشت مایکوباکتریوم­ها بخصوص باکتریM. tuberculosis می­باشد.

۳-۷-۱. مواد مورد نیاز
پودر محیط ۷H9، گلیسرین و یا پلی سوربات۸۰ و ADC^[70] (آدنوزین دئوکسی کاتالاز)
۳-۷-۱-۱. آماده ­سازی محیط
۳۵/۲ گرم از پودر محیط ۷H9 در ۴۵۰ میلی­لیتر آب مقطر حل ­گردید.
۲ میلی­لیتر گلیسرین به آن اضافه ­شد (یا به جای آن از polysorbate 80 ) و به مدت ۱۰ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد اتوکلاو گردید.
پس از سرد شدن تا دمای ۴۵ درجه سانتی ­گراد، با یک ویال (۵۰۰ میلی­لیتر) از محیط غنی شده میدل بروک ADC (آدنوزین دئوکسی کربونات) به خوبی مخلوط ­گردید.
برای بررسی آلودگی محیط به مدت یک روز در انکوباتور قرار ­گرفت، سپس در یخچال نگهداری شد .(Middlebrool and Cohn., 1958)
پودر محیط ۷H9 حاوی مواد و مقادیر زیر برای ۹۰۰ میلی­لیتر از آب مقطر، به قرار زیر است:
آمونیوم سولفات ۵/۰ گرم
ال-گلوتامیک اسید ۵/۰ گرم
سیترات سدیم ۱ /۰ گرم
پیرودوکسین ۱ گرم
بیوتین ۵/۰ گرم
دی سدیوم فسفات ۵/۲ گرم
فسفات پتاسیم ۱ گرم
سیترات آمونیوم ۰۴/۰ گرم
سولفات منیزیم ۰۵/۰ گرم
کلرید کلسیم ۵/۰ گرم
سولفات روی ۱ گرم
سولفات مس ۱ گرم
ADC حاوی مواد و مقادیر زیر برای ۱ لیتر می­باشد:
کلرید سدیم ۵/۸ گرم
دکستروز ۲۰ گرم
کاتالاز ۰۳/۰ گرم
آلبومین بووین ۵۰ گرم
۳-۷-۱-۲. انتحاب سویه­ها و کشت
برای کشت در این محیط، سویه­های رشد یافته در محیط LJ بنحوی انتخاب شدند کهM. tuberculosis حساس دارای تست­های نیاسین و TCH، فعالیت کاتالازی ۲۲و ۶۸ درجه مثبت و حساس به تمامی آنتی­بیوتیک­ها بوده ­اند و سویه­هایی M. bovis دارای تست نیاسین منفی، فعالیت کاتالازی ۲۲ درجه مثبت، فعالیت کاتالازی ۶۸ درجه منفی، TCH حساس و حساس به تمامی آنتی بیوتیک­ها بوده ­اند.
برای هر سویه ۵۰ میلی­لیتر از محیط ۷H9 را در ارلن ریخته و مقدار اندکی از کلونی­های کشت LJ به محیط مایع اضافه ­گردید.
کشت­ها به مدت ۲ هفته در انکوباتور شیکردار قرار گرفت.
بعد از آن ۵۰ میلی­لیتر دیگر از محیط ۷H9 به آنها اضافه کرده و دوباره به مدت ۴ هفته در انکوباتور شیکردار قرار گرفت.
۳-۸. جمع­آوری سویه­ها میکروبی، استخراج و خالص­سازی پروتئین
به منظور تائید رشد کشت­ها، از روش رنگ­آمیزی ذیل-نلسون استفاده ­گردید و کشت­ها یک ساعت با rpm 3000 و دمای ۳ درجه سانتی ­گراد سانتریفیوژ ­شد، سپس محلول رویی را به منظور بررسی پروتئین­های ترشحی و رسوب حاصله که حاوی کلنی­های باکتری بوده مورد ارزیابی قرار ­گرفت.
۳-۸-۱. استخراج پروتئین­های غشایی
۳-۸-۱-۱. مواد مورد نیاز
بافر تخلیص^[۷۱]، مهارکننده­های پروتئاز^[۷۲]، ازت مایع، محلول EDTA^[73] ۱۰ میلی­مولار، دستگاه سونیکاتور و دستگاه سانتریفیوژ یخچال­دار
۳-۸-۱-۲. تهیه بافر و محلول­ها
بافر تخلیص: طبق جدول زیر مواد آماده شد و در پایان حجم با بهره گرفتن از تریس ۱۰ میلی­مولار به ۲۰۰ میلی­لیتر ­رسید.
جدول۳-۲: مواد تشکیل­دهنده بافر تخلیص