وبلاگ

سنجش پنتوزیدین: بدین منظور محلول محیط کشت بافت در یک دیالیز وارد شده و به مدت ۲۴ ساعت در برابر بافر فسفات دیالیز میگردد و محتوای آن تغلیظ میشود سپس یدید کلریدریک ۶ مول مخلوط و در حرارت بن ماری جوش بمدت ۱۲ ساعت قرار میگیرد سپس محلول سود خنثی میشود. ۱۰۰ میکرولیتر از آن به دستگاه HPLC با فاز معکوس دارای ستون تزریق شده و با محلول ۱/۰ درصد تری فلورواستیک اسید بهمراه استونیتریل با شیب غلظت ۸۷٫/. از استنیتریل بمدت ۸۰ دقیقه شستشو میشود پیک پنتوزیدین بر اساس استاندارد آن با خروجی ۶۷ دقیقه توسط دتکتور فلورسنس سنجش میگردد و مقدار آن بر حسب پیکو مول بر میلی گرم پروتئین گزارش میشود.
۳-۲ سنجش گلای اکسال:
این ماده در اثر اکسیداسیون گلوکزبوجود میاید. برای سنجش آن در محیط کشت بافت عصاره استخراجی از روش wells-knecht استفاده میشود. بدین منظور ۱۰۰ میکرولیتر از عصاره با ۸۰۰ میکرولیتر فورمات سدیم ۵/۰ نرمال (۹/۲ (PH و ۱۰۰ میکرولیتر محلول گیرارد-T در حرارت ۳۷ درجه سانتی گراد بمدت ۳۰ دقیقه انکوبه مشود سپس جذب آن در طول موج ۲۹۴ نانومتر اندازه گرفته شده و بر اساس منحنی استاندارد تعیین میگردد مقدار آن بر حسب (میکرومول) بیان میشود.

ماده DPPH خود رادیکال آزاد میباشد که جذب ان در ۵۱۷ نانومتر است اگر در داخل صاره عوامل ضد رادیکالی باشند و بتوانند DPPH را ازبین ببرند میزان جذب ان کاهش میابد لذا به محلول تازه حاوی DPPH از عصاره اضافه میشود سپس جذب سریعا در ۵۱۷ قرائت میگردد این مخلوط ۳۰ دقیقه انکوبه میشود و مجددا OD قرائت میگردد بدیهی است جذب بدلیل وجود عوامل ضد رادیکالی کاهش میابد تفاوت جذب اولیه و ثانویه بر حسب درصد نشان دهنده درصد مهار DPPH است هر چقدر این درصد بیشتر شود فعالیت ضد رادیکالی محلول بیشتر است. ۱ـ کاتالاز (Cataloase): آنزیم کاتالاز که دارای EC 1.11.1.6 می باشد با مصرف H₂O₂ (ضریب خاموشی ۰٫۰۳۹۴ mMcm^_1) در ۲۴۰nm به مدت ۳۰ s تعیین فعالیت می گردد(Aeby, 1984) . مخلوط دارای ۱۰۰mM بافرفسفات پتاسیم (pH 7.0)، ۱۵mM H₂O₂ و ۵۰ ml عصاره در۳ ml حجم را می سنجند. (واحد فعالیت آنزیم(Unit) مقدار آنزیمی که بتواند در۱ دقیقه یک nmol H₂O₂ (سوبسترا) را تجزیه کند یا به محصول تبدیل نماید).
۲ـ گلوتاتیون پراکسیداز ( (Glutathione peroxidase: برای تعیین فعالیت این آنزیم، از روش (Hopkins & Tudhope (1973 استفاده می شود که در این روش t ـ بوتیل هیدروپراکسید بعنوان سوبسترا مورد استفاده قرار می دهند. مخلوط که شامل ۵۰mM بافر فسفات پتاسیم، pH 7.0، ۲mM EDTA، ۰٫۲۸ mM NADPH ، ۰٫۱۳mM GSH، ۰٫۱۶ U GR ، ۰٫۰۷۳mM t ـ بوتیل هیدروپراکسیدو آنزیم استخراجی (۵۰mg پروتئین) می باشد. (واحد فعالیت GSH-Px به مقدار آنزیمی که اکسیداسیون NADPH را کاتالیز کند گویند) (mmol min^_1 mg^_1 protein).
۳ـ سوپراکسیددیسموتاز (SOD): تعیین فعالیت SOD بر اساس روش Minami & Yoshikawa (1979) انجام می گیرد این روش حاوی ۵۰mM بافر نمک Tris–Ca–codylic sodium، pH 8.2 و ۰٫۱mM EDTA است. مخلوط که شامل ۱٫۴۲% ترتیون X-100، ۰٫۰۵۵mM نیتروبلوتترازولیوم (NBT)، ۱۶mM پیروگالول و آنزیم استخراجی (۵۰mg پروتئین) می باشد. واحد فعالیت (۵۰٪ مهارکنندگی ) بر طبق تعریف McCord and Fridovich (1969) بنیاد می گردد. واحد یا یکان فعالیت بعنوان مقدار آنزیم مورد نیاز برای مهار احیاء ۵۰٪ NBT در هر یک دقیقه را می گویند.
اندازه گیری O,O′ـ دی تیروزین:
O,O′ـ دی تیروزین با HPLC فاز ـ معکوس و دتکتورUV در طول موج nm 280 و با تابش توام نور فلورسانس شناسایی میگردد (ex. 280 nm, em. 410 nm). phenomenex inertsil ODS 2 (150_4.6 mm, 5mm) ستون گارد HPLC (Bester, Amsterdam, The Netherlands) برای این آنالیز مورد استفاده قرار می گیرد. وگرادیانی که از۱۰mM استات آمونیوم، در pH 4.5 با اسید استیک و متانول، در مدت۳۰ دقیقه ایجاد می گردد. سرعت جریان ۰٫۸ ml/min است و استاندارد نمونه دی تیروزین بر طبق روش Amado و همکاران (۱۹۸۴)انجام می گیرد.
۳-۳ آنالیز مالون دی آلدئید:
پروتئین های بافت هموژنات با ۴۰٪ اسیدتری کلرواستیک (TCA)، تراکم W/V یک مولکول مالون دی آلدئید(MDA)با دو مولکول اسید تیوباربیتوریک (TBA)را رسوب می دهند و کروموژن ایجاد شده قابلیت جذب نور UV را دارد. کمپلکس TBA+MDA بااستفاده از HPLC که توسط روش Bird و همکاران (۱۹۸۳)شرح داده شده آنالیز می شوند. Aliquots نمونه های TBA+MDA به ستون Supelcosil به قطر mm5 (LC-18) به روش فاز معکوس تزریق می شود ۳۰×۴٫۶mm2)). فاز متحرک شامل ۱۵٪ متانول در doubleـ آب مقطر degassed که توسط یک فیلتر mm0.5 فیلتر می گردد (Bedford, MA, USA (Millipore, و سرعت جریان ۲ ml/min است.
انجام آزمایشات با سه تکرار و محاسبه میانگین و انحراف معیار و مقایسه نتایج با آزمون SSPSو ANOVA test وتعیین سطح معنی دار بودن در مقایسه نتایج در سطح p<0.05
ب- متغیرهای مورد بررسی در قالب یک مدل مفهومی و شرح چگونگی بررسی و اندازه گیری متغیرها:

غلظت مواد، مقدار فعالیت آنزیمها، مقدار بیو مارکرهای تخریب اکسیداتیو
ج – شرح کامل روش (میدانی، کتابخانه‏ای) و ابزار (مشاهده و آزمون، پرسشنامه، مصاحبه، فیش‏برداری و غیره) گردآوری داده‏ها :
د – جامعه آماری، روش نمونه‏گیری و حجم نمونه (در صورت وجود و امکان):

آزمایشی سه بار تکرار میشود.
هـ - روش‌ها و ابزار تجزیه و تحلیل داده‏ها:

میانگین سه بار تکرار توسط نرم افزار spss با روش Anova ارزیابی آماری میشود و تفاوت نتایج نسبت به هم در سطح p<0/05 ارزیابی میشود.
فصل چهارم
نتایج و بحث
جدول ۴-۱: تجزیه واریانس تاثیر مقادیر متفاوت ماده جاسمونیک اسید بر روی فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانی و برخی شاخصهای بیوشیمیائی بافت ریه بعد از اتمام ۲۴ ساعت انکوباسیون .