وبلاگ

این کار به کمک دستگاه اسپکتروفوتومتر و با بهره گرفتن از LB مایع به‏عنوان blank جهت کالیبره کردن دستگاه به منظور جذب در طول موج ۶۰۰ نانومتر برای باکتری‏های مورد استفاده انجام گرفت. OD لحاظ شده برای ۳ گونه باکتری مورد استفاده در این پژوهش، بین ۱-۴/۰ در نظر گرفته شد.

تکنیک Colony-PCR : غربالگری کلونی‏های نوترکیب
به منظور اطمینان از انجام صحیح واکنش اتصال و همچنین ترانسفورماسیون، پس از رشد باکتری حامل سازه‏ی نوترکیب روی محیط کشت انتخابی و پس از گزینش کلون‏های مورد نظر این حامل جهت تایید فرایندهای مذکور و همچنین تکثیر ژن هدف انجام می گیرد. در این واکنش همانند PCR معمولی عمل کرده با این تفاوت که از کلون‏های به‏دست آمده به‏عنوان الگو در واکنش PCR استفاده می‏شود. لازم به ذکر است که مقدار رسوب باکتری که با نوک سمپلر از پلیت برداشته می‏شود بسیار ناچیز می‏باشد که می‏بایست به خوبی ابتدا در آب واکنش PCR حل شده و سپس اجزای دیگر واکنش که در قالب محلول مادری آماده شده به آن اضافه گردد (جدول ۱۸-۲).
استخراج پلاسمید در مقیاس کم (Mini-Preparation)
در این پژوهش جهت استخراج پلاسمید از کیت مربوطه، تهیه شده از شرکت Roche و براساس پروتکل شرکت سازنده صورت پذیرفت (پیوست۵-۷) و در نهایت کمیت و کیفیت پلاسمید استخراج شده با هر دو روش اسپکتروفوتومتری و الکتروفورز بر روی ژل آگارز ۱% اندازه گیری و بررسی شد.
توالی‏یابی
جهت تعیین توالی ژن به منظور اطمینان از صحت قطعه تکثیر شده و عدم وجود جهش کلونی‏های حامل قطعه‏ی مورد نظر که با واکنش Colony PCR و هضم آنزیمی تایید شدند، برای تعیین توالی به شرکت ژن فن‏آوران فرستاده شد. تعیین توالی ژن‏های هدف با بهره گرفتن از آغازگرهای اختصاصی ژن انجام گردید. پس از دریافت نتایج تعیین توالی، توالی برای عدم وجود تغییرات نوکلئوتیدی با نرم‏افزارهای مربوطه مورد بررسی قرار گرفت.
انتقال پلاسمید نوترکیب pBI-hrpW و pBI-hrpG به سویه‏های آگروباکتریوم تومفاسینس با بهره گرفتن از روش ذوب و انجماد
پلاسمیدهای نوترکیب ساخته شده پس از تایید تعیین توالی از باکتری اشرشیاکلای استخراج شده و به باکتری آگروباکتریوم تومفاسینس سویه‏های LBA4404 و GV3101 با بهره گرفتن از روش ذوب و انجماد انتقال داده شدند (هافجن و ویل متیزر، ۱۹۸۸). بدین منظور ابتدا سلولهای مستعد از باکتری آگروباکتریوم تهیه شده و سپس عمل تراریزش این باکتری ها طبق پیوست (۵-۸) صورت پذیرفت. در نهایت این سویه‏های آگروباکترویوم تومفاسینس را بعد از تایید نهایی با واکنش زنجیره‏ای پلیمراز می‏توان برای انتقال به گیاه هدف مورد استفاده قرار داد. لازم به ذکر است که قبل از انتقال به گیاه هدف عمل همانند‏سازی پلاسمید نوترکیب در این باکتری و بر روی محیط انتخابی و همچنین باColony PCR مورد تایید قرار گرفت (جدول۱۸-۲).
جدول۱۷-۲- چرخه حرارتی به‏کار رفته برای واکنش کلونی PCR به منظور تایید همسانه‏سازی در وکتور بیانی

جدول۱۸-۲ – ترکیبات محلول مادری واکنش زنجیره‏ای کلونی PCR جهت تایید عمل همسانه‏سازی در وکتورهای کلونینگ و بیانی.