جداسازی نهایی
کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)
کروماتوگرافی گاز – مایع (GLC)
کروماتوگرافی مایع – مایع (LC)
کروماتوگرافی مایه با کارایی بالا (HPLC)
تفکیک ترکیبات مداخله‌گر تعیین کمی و کیفی سموم
شناسایی و تعیین کمیّت
مشاهده فلئورسنس برروی صفحات TLC،
مشاهده‌ی فلئورسنس در محلول، جذب UV در محلول، شناسانگر شعله‌ای GLC
شناسایی و تخمین غلظت
تأیید نهایی
جداسازی با بهره گرفتن از TLC و شناسایی مشتقات مایکوتوکسین
تست‌های بیوشیمیایی (نظیر NMR)
اسپکترومتری توده ای
آزمون‌های بیولوژیک
تعیین هویت ترکیب شیمیایی
۱-۲۰ روش‌های آنالیز
یک روش آنالیز ایده‌آل برای بررسی مایکوتوکسین‌ها باید ساده ، سریع، دقیق، حساس، انتخابی و اقتصادی باشد و از آنجایی که هیچ روش آنالیزی که واجد تمامی معیارهای فوق‌الذکر باشد در دسترس نیست، همواره باید روشی انتخاب شود که در مجموع با توجه به شرایط موجود مناسب‌تر از سایرین باشد. به طور کلی، دو گروه اصلی از روش‌های آنالیز برای مایکوتوکسین‌ها وجود دارد که عبارتند از : ۱- روش‌های بیوشیمیایی ۲- روش‌های بیولوژیکی.
۱-۲۰-۱ روش‌های بیولوژیک
بررسی سمیت یک مایکوتوکسین در حقیقت بررسی آزمایشی (تجربی) اثر سم مورد ظن بر روی یک سیستم زنده است. تاکنون کوشش‌های فراوانی جهت یافتن سیستم‌های بیولوژیک مناسب واجد صحت و سرعت بالا و هزینه اندک انجام گرفته است. آزمون‌های بیولوژیک مورد استفاده جهت ارزیابی سمیت مایکوتوکسین‌ها در جدول ۵-۱ به نمایش گذاشته شده است(۵).
۱-۲۰-۲ روش‌های بیوشیمایی
۱-۲۰-۲-۱ روش های کروماتوگرافی[۱۱۳] شامل:
۱-کروماتوگرافی لایه نازک[۱۱۴]
۲-کروماتوگرافی ستون کوچک[۱۱۵]
۳-کروماتورگرافی مایع[۱۱۶]باکارایی بالا[۱۱۷]
۵-کرومتوگرافی گاز – مایع[۱۱۸]
کروماتوگرافی لایه نازک رایج‌ترین روش آنالیز به کار گرفته شده برای جداسازی و شناسایی مایکوتوکسین‌ها محسوب می‌شود. این روش مراحلی نظیر پوشاندن یک صفحه با ژل به عنوان فاز ساکن، قرار دادن نمونه تغلیظ شده بر روی خط پایه، تفکیک توسط فاز متحرک، خشک کردن و شناسایی لکه‌های حاصل از نمونه می‌باشد. یک مایکوتوکسین در مورد هر سیستم حلال، الگوی مهاجرت و جداسازی اختصاصی خواهد داشت که براساس حرکت نسبی Rf آن قابل محاسبه است(۵).
۱-۲۰-۳ روش‌های سنجش ایمونولوژیک[۱۱۹]
امروزه روش‌های ساده‌تر و اختصاصی‌تر برای شناسایی مایکوتوکسین‌ها ابداع گردیده است که اساس آن‌ها بر سنجش‌های ایمونولوژیک استوار است. چنین روش‌هایی در مواردی نظیر محدودیت دسترسی به نمونه، حضور غلظت‌های بسیار پایین مایکوتوکسین در نمونه و نیاز به آنالیز تعداد زیادی از نمونه‌ها می توانند جایگزین مناسبی برای سایر روش‌ها باشند (۵).
۱-۲۰-۳-۱ رادیوایمونواسی[۱۲۰]
این روش بر اساس رقابت بین یک آنتی‌ژن غیرنشاندار و یک آنتی‌ژن نشاندار شده با ترکیبات رادیواکتیو در اتصال به یک آنتی‌بادی اختصاصی با غلظت مشخص استوار است . آنتی‌ژن و آنتی‌بادی اختصاصی از طریق یک واکنش برگشت‌پذیر به یکدیگر متصل شده و بدین ترتیب یک کمپلکس محلول آنتی‌ژن – آنتی‌بادی تشکیل می‌دهند. تحت این شرایط، کمپلکس آنتی‌ژن نشاندار – آنتی‌بادی واجد خاصیت رادیواکتیو خواهد بود. در صورتی که آنتی‌ژن‌های غیرنشاندار به سیستم افزوده شود، رقابت بین آنتی‌ژن‌های نشاندار و غیرنشاندار برای اتصال به جایگاه‌های اختصاصی موجود بر روی آنتی‌بادی ایجاد خواهد شد.
مزایای اصلی این روش شامل حساسیت و ویژگی بالا و توانایی بررسی تعداد زیادی نمونه می‌باشد (۵).
۱-۲۰-۳-۲ الایزا[۱۲۱]
امروزه روش الایزا به عنوان روش پیشتاز در غربال‌گری آفلاتوکسین B1 با سطح غربال کمتر از ۱۵ نانوگرم در گرم در پنبه دانه و ۲۰ نانوگرم در گرم در ذرت، بادام زمینی و روغن بادام زمینی مطرح می‌باشد(۸۵).
این روش سنجش ایمونولوژیک به علت عدم نیاز به ترکیبات رادیواکتیو و تجهیزات اختصاصی نظیر شمارشگر مواد رادیواکتیو ساده‌تر از روش رادیوایمونواسی است. روش‌های الایزا بر پایه استفاده از آنتی‌بادی‌ها و یا آنتی‌ژن‌های متصل به یک سطح جامد استوار می‌باشند. کمپلکس ناشی از مجاورت آنتی‌ژن با آنتی‌بادی در یک سیستم محلول آزمایش با بهره گرفتن از یک آنتی‌بادی و یا آنتی‌ژن متصل به آنزیم مورد شناسایی قرار می‌گیرد. تخریب یا تجزیه سوبسترای آنزیم به طور طبیعی با بهره گرفتن از اسپکتروفوتومتر قابل بررسی است و با غلظت آنتی‌بادی و یا آنتی‌ژن مجهول متناسب می‌باشد.
روش‌های الایزا را می‌توان در سه گروه شامل شناسایی آنتی‌بادی با بهره گرفتن از آنتی‌گلوبولین‌های متصل به آنزیم، شناسایی آنتی‌ژن به وسیله روش آنتی‌بادی دوگانه و شناسایی آنتی‌ژن با بهره گرفتن از روش رقابت آنتی‌ژن نشاندار طبقه‌بندی کرد. مارکرهای آنزیمی معمولاً آلکالین فسفاتاز و یا پراکسیداز می‌باشند (۵).
جدول ۵-۱: آزمون‌های بیوژیک مورد استفاده جهت ارزیابی سمیت مایکوتوکسین‌ها(۵)
نوع آزمون
مایکوتوکسین
فرم در حال بارگذاری ...