وبلاگ

برای این مطالعه با بهره گرفتن از سواب استریل، مقدار کمی از کشت خالص ارگانیسم رادر سرم فیزیولوژی حل نموده. سپس یک قطره از پراکسید هیدروژن ۳% (H2O2) به آن اضافه می­کنیم . سپس از نظر آزاد شدن حباب‌های گاز اکسیژن لازم را مورد بررسی قرار می‌دهیم. آزاد شدن حباب‌های گاز نشان دهنده وجود آنزیم کاتالاز در میکروارگانیسم است که موجب شکسته شدن پراکسید هیدروژن به آب و اکسیژن می‌گردد. ۳-۷-ﺗﻤﺎﯾﺰ انتروکوک­ها از ﺳﺎﯾﺮ استرپتوکوک­ها ﺑﺎﮐﺘﺮی ﻣﺸﮑﻮک ﺑﻪ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس فکالیس روی ﻣﺤﯿﻂ آﮔﺎرﺧﻮﻧﺪار ۵% ﮐﺸﺖ داده ﻣﯽ ﺷﺪند و دﯾﺴﮑﻬﺎی ﺑﺎﺳﯿﺘﺮاﺳﻦ و ﺗﺮی ﻣﺘﻮﭘﺮﯾﻢ ﺳﻮﻟﻔﺎﻣﺘﻮﮐﺴﺎزول () sxtروی ﻣﺤﯿﻂ ﮐﺸﺖ ﻗﺮار داده ﻣﯽ ﺷﺪ. ﭘﺲ از ۲۴ ﺳﺎﻋﺖ اﻧﮑﻮﺑﺎﺳﯿﻮن در C0 ۳۷، از ﻃﺮﯾﻖ ﻋﺪم رﺷﺪ ﺑﺎﮐﺘﺮی در ﻣﺠﺎورت اﯾﻦ دﯾﺴﮏ­ﻫﺎ، ﺑﻪ اﻧﺘﺮوﮐﻮک ﺑﻮدن آﻧﻬﺎ ﻣﺸﮑﻮک ﻣﯽ ﺷﺪﯾﻢ (۱، ۱۷۰). ۳-۷-۱- ﮐﺸﺖ ﺑﺮ روی ﺑﺎﯾﻞ اﺳﮑﻮﻟﯿﻦ آﮔﺎر ﮐﻠﻨﯽ­ﻫﺎی ﻣﺸﮑﻮک ﺑﻪ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس فکالیس روی ﻣﺤﯿﻂ ﺑﺎﯾﻞ اﺳﮑﻮﻟﯿﻦ آﮔﺎرﮐﺸﺖ داده می شوند و ﺑﻌﺪ از ۲۴ ﺳﺎﻋﺖ اﻧﮑﻮﺑﺎﺳﯿﻮن در ۳۷ درﺟﻪ سلسیوس، ﺗﻐﯿﯿﺮ رﻧﮓ ﻣﺤﯿﻂ از زرد ﺑﻪ ﻗﻬﻮه ای ﺗﯿﺮه ﺗﺎ ﺳﯿﺎه ﻧﺸﺎن دﻫﻨﺪه ﻫﯿﺪروﻟﯿﺰ اﺳﮑﻮﻟﯿﻦ ﺑﻮد. در اﯾﻦ واﮐﻨﺶ اﺳﮑﻮﻟﯿﻦ ﺑﻪ ۶ و ۷ دی ﻫﯿﺪروﮐﺴﯽ ﮐﻮﻣﺎرﯾﻦ ﺗﺒﺪﯾﻞ ﺷﺪه و اﯾﻦ ﻣﺎده ﺣﺪ واﺳﻂ، در ﺣﻀﻮر آﻫﻦ رﻧﮓ ﻣﺤﯿﻂ را ﺑﻪ رﻧﮓ ﻗﻬﻮه ای ﺗﺒﺪﯾﻞ ﻣﯽ ﮐﻨﺪ. انتروکوک­های و استرپتوکوک­های گروه D ﻫﺮ دو ﻗﺎدر ﺑﻪ ﺗﺠﺰﯾﻪ اﺳﮑﻮﻟﯿﻦ می‌باشند وﻟﯽ ﺟﻬﺖ ﺟﺪا ﻧﻤﻮدن آن دو از ﯾﮑﺪﯾﮕﺮ از رﺷﺪ در محیط %۶.۵ نمک اﺳﺘﻔﺎده می­ﮐﻨﻨﺪ. (۱, ۱۷۰). ﺗﺴﺖ ﺗﺨﻤﯿﺮ ﻗﻨﺪآراﺑﯿﻨﻮز از تست تخمیر قند آرابینوز برای جداسازی دو سویه استفاده می­ شود. به این صورت که ﻣﺤﯿﻂ ﭘﺎﯾﻪ ﺣﺎوی دو درصد آراﺑﯿﻨﻮز ﭘﺲ از ﺗﻠﻘﯿﺢ انتروکوک، ﺑﻪ ﻣﺪت ۲۴ ساعت در ۳۷ درجه سلسیوس گرمخانه گزاری ﺷﺪﻧﺪ. ﺗﻐﯿﯿﺮ رﻧﮓ ﻣﺤﯿﻂ از صورتی ﺑﻪ زرد ﻧﺸﺎن دهنده ﻣﺼﺮف ﻗﻨﺪ و ﺗﻮﻟﯿﺪ اﺳﯿﺪ می­باشد. اﮔﺮ ﻗﻨﺪ ﻣﺼﺮف ﻧﺸﻮد رﻧﮓ ﻣﺤﯿﻂ، صورتیﺑﺎﻗﯽ ﻣﯽ­ﻣﺎﻧﺪ. ﮐﻨﺘﺮل ﻣﺜﺒﺖ در اﯾﻦ ازﻣﺎﯾﺶ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﺎﺳﯿﻮم ۹۵۵۱۵ ATCC و ﮐﻨﺘﺮل ﻣﻨﻔﯽ اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ ATCC21292بود. ۳-۸ رﺷﺪ در ۱۰ و ۴۵ درﺟﻪ سلسیوس ﺑﺎﮐﺘﺮی ﻣﻮرد ﻧﻈﺮ در در TSB ﮐﺸﺖ داده ﺷﺪه و در ۴۵ درﺟﻪ ﺳﺎﻧﺘﯽ ﮔﺮاد گرم خانه گذاری می شدندوبرای بررسی رشد در C0 ۱۰ ازیخچال استفاده می­ شود. ﺑﺮای اﻧﺠﺎم اﯾﻦ ﺗﺴﺖ ﺑﺎﯾﺪ از ﮐﻠﻨﯽ­ﻫﺎﯾﯽ ﮐﻪ ۲۴ -۱۸ ﺳﺎﻋﺖ ﮐﺸﺖ آﻧﻬﺎ ﮔﺬﺷﺘﻪ اﺳﺘﻔﺎده ﮐﺮد. زﻣﺎن ﺗﻠﻘﯿﺢ ﺗﺎ اﻧﮑﻮﺑﺎﺳﯿﻮن در ۱۰ ﯾﺎ ۴۵ درﺟﻪ ﻧﺒﺎﯾﺪ ﺑﯿﺶ از ۱۰ دﻗﯿﻘﻪ ﺑﺎﺷﺪ. اﻧﺘﺮوکوکوس فکالیس در ۱۰ و ۴۵ درﺟﻪ رﺷﺪ ﻣﯽ­ﮐﻨﻨﺪ وﻟﯽ ﻟﮑﻮﻧﺴﺘﻮک در ۱۰ درﺟﻪ ﺳﺎﻧﺘﯿﮕﺮاد ﻗﺎدر ﺑﻪ رﺷﺪ ﻧﻤﯽ ﺑﺎﺷﻨﺪ. ﺑﺮای ﺗﺎﯾﯿﺪ روﺷﻬﺎی ﺗﺸﺨﯿﺺ از اﻧﺘﺮوﮐﻮکوس ﻓﮑﺎﻟﯿﺲ ۲۱۲۹۲ ATCC ﺑﻪ ﻋﻨﻮان ﺳﻮﯾﻪ اﺳﺘﺎﻧﺪارد اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ (۱, ۱۷۰). ۳-۹-ﺗﻌﯿﯿﻦ اﻟﮕﻮی ﺣﺴﺎﺳﯿﺖ آﻧﺘﯽ ﺑﯿﻮﺗﯿﮑﯽ انتروکوکوس فکالیس ۳-۹-۱- استاندارد نیم مک فارلند سولفات باریم: نیم میلی لیتر از کلرور باریم (BaCl2) mol/l 48.0.175 (2H2O .W/V BaCl2. 1%) را به ۵ml.99 اسید سولفوریکmol/ (V/V) 1 18.0%) اضافه کنید و با هم زدن مداوم سوسپانسیون بدست آورید. چگالی صحیح کدورت استاندارد با بهره گرفتن از اندازه گیری جذب در اسپکترو­فتومتر با طول مسیر نوری cm1، مشخص شود. جذب در nm 625 باید بین ۸/۰ تا ۱۳/۰ باشد. سوسپانسیون سولفات باریم باید به مقدار ml 6-4 در لوله های در پیچ دار هم اندازه با لوله­های سوسپانسیون باکتریایی ریخته شود. درب این لوله ها باید محکم بسته شوند و در دمای اتاق و در تاریکی نگهداری گردند. استاندارد سولفات باریم قبل از هر بار استفاده باید به شدت (ترجیحا با ورتکس مکانیکی) همزده شود، تا کدورت یکنواختی ایجادگردد. در صورت مشاهده ذرات بزرگ، باید استاندارد تازه­ای تهیه گردد. استاندارد سولفات باریم باید به صورت ماهانه جایگزین شود یا جذب آن اندازه گیری گردد. ۳-۹-۳ آﻣﺎده ﮐﺮدن ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﯿﻮن ﺑﺎﮐﺘﺮی: چند کلنی از ﺑﺎﮐﺘﺮی ﻣﻮرد ﻧﻈﺮ در سرم فیزیولوژی تلقیح می شود وکدورت آن رابامعادل۰.۵ مک ﻓﺎرﻟند Cfu/m 5/1× ۱۰۸ ﺑﺮرﺳﯽ می­گردد (۱۷۱). ۳-۱۰-روش اﻧﺠﺎم آزﻣﺎﯾﺶ: ﯾﮏ ﺳﻮآب اﺳﺘﺮﯾﻞ ﺑﻪ ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﯿﻮن ﻣﯿﮑﺮوﺑﯽ آﻏﺸﺘﻪ ﺷﺪه (اﺿﺎﻓﻪ ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﯿﻮن ﺑﺎ ﻓﺸﺎردادن ﺳﻮاب ﺑﻪ ﺑﺪﻧﻪ داﺧﻠﯽ ﻟﻮﻟﻪ ﺧﺎرج ﻣﯽ ﺷﺪ) ﺳﭙﺲ ﺗﻤﺎﻣﯽ ﺳﻄﺢ ﯾﮏ پلیت ﻣﺤﯿﻂ ﮐﺸﺖ ﻣﻮﻟﺮ ﻫﯿﻨﺘﻮن آﮔﺎر ﮐﻪ یک ساعت قبل در دمای اتاق قرار داده شده است، ﺗﻮﺳﻂ ﺳﻮآب آﻏﺸﺘﻪ ﺑﻪ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻣﯿﮑﺮوﺑﯽ و ﺑﺎ ﺣﺮﮐﺖ و ﻣﺎﻟﺶ ﺳﻮآب در ﺗﻤﺎﻣﯽ ﺳﻄﺢ ﻣﺤﯿﻂ و ﺑﺎ زاوﯾﻪ ۶۰ درﺟﻪ، ﺗﻠﻘﯿﺢ ﻣﯽ ﺷﺪ (کشت خطی). ۳ ﺗﺎ ۵ دﻗﯿﻘﻪ از ﺗﻠﻘﯿﺢ ﻣﺤﯿﻂ ﮐﺸﺖ ﺑﺎ ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﯿﻮن ﺑﺎﮐﺘﺮﯾﺎﯾﯽ، دﯾﺴﮏ ﻫﺎی اﺳﺘﺎﻧﺪارد آﻣﺎده آﻧﺘﯽ ﺑﯿﻮﺗﯿﮏ را در ﺳﻄﺢ ﻣﺤﯿﻂ ﻗﺮار داده می شوند. ﭘﻠﯿﺖ ﻫﺎ ﺑﻪ ﻣﺪت ۲۴ ﺳﺎﻋﺖ در درﺟﻪ C0 ۳۷-۳۵ در اﻧﮑﻮﺑﺎﺗﻮر ﻗﺮار ﮔﺮﻓﺘﻨﺪ (۱۷۱). ﺳﭙﺲ ﻗﻄﺮ ﻧﺎﺣﯿﻪ ﻋﺪم رﺷﺪ در اﻃﺮاف دﯾﺴﮏ­ﻫﺎی آﻧﺘﯽ ﺑﯿﻮﺗﯿﮑﯽ ﺑﻮﺳﯿﻠﻪ ﺧﻂ ﮐﺶ اﻧﺪازه ﮔﯿﺮی ﺷﺪه و ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از ﺟﺪول اﺳﺘﺎﻧﺪارد. ﺣﺴﺎﺳﯿﺖ و ﻣﻘﺎوﻣﺖ انتروکوک­هاﺗﻌﯿﯿﻦ ﮔﺮدﯾﺪ. ۳-۱۱-بررسی مقاومت افزایش یافته به جنتامایسین و استرپتومایسین باکتری­ های مشکوک به HLAR[62] با روش غربالگری دیسک دیفیوژن جدا سازی شدند. در این روش ابتدا یک کشت تازه با غلظت معادل نیم مک فارلند تهیه شده و با سواب استریل بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت خطی داده شد. سپس دیسک های جنتامایسین ( ۱۲۰ میکروگرم) و استرپتومایسین (۳۰۰ میکروگرم) بر روی محیط کشت آگار قرار داده شد. پلیت ها در C0 ۳۷ و به مدت ۲۴ ساعت گرم خانه گزاری شدند. سپس قطر منطقه عدم رشد با خط کش اندازه گیری شد. مقاومت با مشاهده رشد کامل باکتری دراطراف دیسک گزارش شده و حساسیت بامنطقه ممانعت ازرشد بیشتر از ۱۰ میلی متر گزارش شد. مناطق ممانعت از رشدبین ۷ تا ۹ میلی متر نیز به عنوان حدواسط در نظر گرفته شدند. از E. fecalis ATCC 29212 به عنوان شاهد حساس و از E. fecalis ATCC 51299 به عنوان شاهد مقاوم به عنوان کنترل استفاده شد. ۳-۱۲-آماده سازی و انجام واکنش زنجیره پلی مراز ۳-۱۲-۱-اﺳﺘﺨﺮاج DNA اﺳﺎس اﺳﺘﺨﺮاج ژﻧﻮم از ﺗﻤﺎم ﻧﻤﻮﻧﻪ ﻫﺎی ﺣﺎوی DNAﯾﮑﺴﺎن می‌باشد وﻟﯿﮑﻦ ﺑﺎ ﺗﻮﺟﻪ به اینکه چه کاربردی از DNA حاصله ﻣﺪ ﻧﻈﺮ اﺳﺖ ﻣﯽ ﺗﻮان از اﻧﻮاع روش­های ﻣﺨﺘﻠﻒ اﺳﺘﻔﺎده کرد. اﯾﻦ ﻣﺮاﺣﻞ به طور کلی ﺷﺎﻣﻞ ﻣﻮراد زﯾﺮ می‌باشد: آﻣﺎده ﺳﺎزی ﻧﻤﻮﻧﻪ ها از ﺑﯿﻦ ﺑﺮدن دﯾﻮاره ﺳﻠﻮﻟﯽ ﯾﺎ ﻟﯿﺰ ﮐﺮدن ﺳﻠﻮﻟﻬﺎ ﺟﺪاﮐﺮدن ﻣﻮاد ﻏﯿﺮ از DNA ﺧﺎﻟﺺ ﺳﺎزی DNAاز ﻧﺎﺧﺎﻟﺼﯽ ﻫﺎ ﺗﻐﻠﯿﻆ DNA ۳-۱۲-۲-استخراج از باکتری کشت داده شده : برای این منظور با آزمایش مستقیم از نمونه محیط کشت بلادآگار دارای کلنی تک، خلوص کشت تائید شد سپس بوسیله فیلدوپلاتین تعداد هشت کلنی یک شکل‌ و یک اندازه در زیر هود بیولوژیک کلاسII و مجاورت شعله (شرایط استریل) برداشته شد و در ۳۰۰ ماکرولیتر آب مقطر دو بار تقطیر در زیر هود بیولوژیک سوسپانسیون تهیه گردید. سپس تیوپ محتوی نمونه به مدت ۳۰ دقیقه در ماکروفر با دمای ۱۰۰ سلسیوس قرار گرفت. پس از آن تیوپ ورتکس شد. در مرحله بعد مقدار µl250 آب مقطر دوبار تقطیر به مخلوط افزوده شد و تیوپ به بن ماری ۵۵ – ۵۶ درجه سلسیوس بمدت ۱۵ دقیقه منتقل گردید و ورتکس میکروتیوپ انجام شد. تیوپ محتوی مخلوط بمدت یک دقیقه و دمای ۱۹ درجه سلسیوس و دورrpm 7000 سانتریفیوژ شد. پس از بیرون آوردن از دستگاه سانتریفوژ دو فاز (رسوب DNA و مایع روئی شفاف) تشکیل شد، که غلظت DNA در مرحله بعد تعیین گردید. ۳-۱۲-۳-اندازه‌گیری غلظت DNA ژنومیک تخلیص شده با این روش می‌توان غلظت نمونه DNA را به کمک جذب نوری آن در طول موج nm 260 و با بهره گرفتن از رابطه زیر به دست آورد. بدین منظور از دستگاه اسپکتروفوتومتر استفاده شد. چنانچه در مراحل استخراج DNA، از RNase برای از بین بردن RNA استفاده شده باشد، جذب نوری در nm 260، فقط میزان DNA را نشان خواهد داد. در این طول موج یک واحد جذب، معادل ۵۰ میکروگرم DNA در هر میلی لیتر است. جذب نوری در طول موج nm 280 نیز وجود پروتئین در نمونه را اثبات می‌کند. جذب اشعه ماوراء بنفش برای بررسی خلوص DNA حاصل هم استفاده می شود. به این صورت که با بررسی نسبت جذب نوری نمونه در nm 260 به جذب آن در nm 280 می‌توان خلوص DNA استخراج شده را تعیین کرد. چنانچه عدد بدست آمده از این نسبت بین ۲-۵/۱ باشد، DNA خالص، و اگر کمتر از ۵/۱ باشد، نمایانگر آلودگی نمونه استخراج شده با پروتئین خواهد بود. اعداد بالاتر از ۲ نشانگر آلودگی با فنل یا RNA هستند. نکته: جذب نوری در طول موج nm 230، شاخص آلودگی نمونه با اوره و یا اجزاء آروماتیک پروتئینها می‌باشد. اساس UV اسپکتروفتومتری می تواند به طور اتوماتیک غلظت DNA را با بهره گرفتن از جذب نوری در طول موج nm 260، محاسبه کند. به این صورت که پس از آماده سازی نمونه و قرار دادن آن در مکان قرارگیری نمونه، دستگاه غلظت نمونه مورد نظر را در طول موج مربوطه محاسبه می نماید. ۳-۱۲-۴-انتخاب و تهیه پرایمر‌های مناسب برای این منظور کلیه مقالات قابل دسترسی مربوط به تشخیص انتروکوکوس فکالیس بروش مولکولی (PCR) مطالعه شد. با بررسی و انتخاب پرایمرهای مورد نظر جفت پرایمرهای ارائه شده در مقاله رفرانس، جهت تعیین میزان همولوژی ناحیه انتخاب شده با ژنوم سایرگونه های مختلف باکتریائی و هم چنین ژنوم جنس و گونه های مختلف انتروکوکس از سایت اینترنتی بنام www.ncbi.nlm.nih.gov و Blast استفاده و تعیین ترادف نوکلئوتیدی انجام گردید. هم چنین جهت ارزیابی خصوصیات پرایمرها از نظر لوپ و…. از برنامه نرم‌افزارهای مولکولی Oligo و Gene runner استفاده گردید. سرانجام جهت سنتز توالی نوکلئوتیدی پرایمر به شرکت تحقیقاتی سیناکلون سفارش ساخت داده شد. جدول ‏۰‑۱: پرایمرهای استفاده شده در این مطالعه برای پیدا کردن سویه‌های مقاوم به آمینوگلیکوزید توالی مورد نظر ژن مقاومت CAGGAATTTATCGAAAATGGTAGAAAAG CACAATCGACTAAAGAGTACCAATC aac(6’)-Ie -aph(2’’)-Ia