وبلاگ

به دست آوردن بهترین و مناسب ترین حامل با توجه به شرایط اقلیمی مورد نظر و نیازهای گیاه مورد نظر بقاء نمونه میکروبی مورد استفاده در فرمولاسیون کود بیولوژیک فسفاته نسبت به خشکی، دما و pH خاک مقایسه تعداد باکتری، قبل و بعد از استفاده کود زیستی در خاک (بقاء باکتری) ۱-۱۶- فرضیه های تحقیق فرمولاسیون کود یولوژیک مورد نظر، بقاء میکروب مورد نظر را در خاک فراهم می‏کند. کود بیولوژیک طراحی شده و به کار گرفته شده، توانایی افزایش رشد گیاه را در فواصل زمانی مختلف دارا می‏باشد. فرمولاسیون اعمال شده در خصوص سویه باکتریایی مورد نظر باعث بقاء ارگانیسم مورد نظر در مقیاس گلخانه خواهد شد. فصل دوم: مروری بر ادبیات و پیشینه تحقیق ۲-۱- پیشینه تحقیق انحلال فسفات توسط میکروارگانیسم های موجود در خاک از دیرباز مورد توجه محققین و دانشمندان بوده است در سال ۲۰۰۰ C.Shekhar Nautiyal و همکارانش مقاله ای با عنوان اعمال استرس به روی باکتری های حل کننده ی فسفات جدا شده از خاک های قلیایی منتشر کردند. وی و همکارانش در این پژوهش ۴ سویه باکتری از ریزوسفر گیاه نخود و خاک های قلیایی جدا کردند. در میان سویه ها، سویه ی NBRI2601 توانست فسفات را در حضور ۱۰% نمک، pH برابر ۱۲ و یا دمای ۴۵ درجه حل کند. علاوه بر این سویه ها فعالیت متفاوتی را در حضور منابع مختلف N و C نشان دادند. همچنین فعالیت آنها در حضور Ca2+ و EDTA از لحاظ انحلال فسفات افزایش یافت. در سال ۲۰۰۲ M.SudhakaraReddy و همکارانش انحلال صخره های فسفاتی توسط Aspergillus tubingensis و Aspergillus niger را مورد مطالعه قرار دادند. آنها را از لحاظ انحلال فسفات صخره های فسفاتی مورد بررسی قرار دادند این سویه ها فعالیت بالاتری را از خود نشان می دادند وقتی که در حضور ۲% از صخره های فسفاتی رشد می کردند. آنها A.tubibgensis را به عنوان سویه ی موثرتر برای انحلال صخره های فسفاتی در مقایسه با سویه های گزارش شده توسط خودشان معرفی کردند و برای اولین بار انحلال فسفات توسط A.tubibgensis و امکان استفاده موثر صخره های فسفاتی برای تولید کود فسفاته توسط وی گزارش شد. در سال ۲۰۰۳ Almaszaidi و همکارانش تاثیر فعل و انفعالات میکروارگانیسم های ریزوسفر روی میزان محصول و ماده غذایی گیاه نخود را بررسی کرده و مشخص شده که میکروارگانیسم ها می توانند تاثیر مفیدی داشته باشند. گیاه در این پژوهش با Rhizobium sp و میکروارگانیسم های حل کننده فسفات مثل Pseudomana striata یا Penicillium variable مورد تلقیح قرار گرفت و افزایش رشد گیاه بین روزهای ۴۵ و ۹۰ را مشاهده کردند. در سال ۲۰۰۵ Robin Duponnis و همکارانش تاثیر صخره های فسفاتی و قارچ های رشته ای Glomus intradices روی رشد گیاه و فعالیت میکروبی در ریزوسفر گیاه Acacia holosercea را مورد بررسی قرار دادند. آنها گیاهان را با قارچ های رشته ای حل کننده فسفات که از خاک های معدنی جدا شدند تلقیح کردند و تاثیر آن روی رشد گیاه، فسفات در دسترس گیاه و فعالیت میکروبی خاک با اضافه شدن یا بدون اضافه شدن صخره های فسفاتی را بررسی کردند و به این نتیجه رسیدند که اضافه کردن صخره های فسفاتی می تواند رشد گیاه را تحریک کند. در سال ۲۰۰۶ Hong Jo Som و همکارانش انحلال فسفر معدنی را توسط R-42 pantoea Agglomerans مقاوم به pH و شوری که از ریزوسفر سویا جدا شده بودند را بررسی کردند. در سال۲۰۰۷ Pratibhav YAS و همکارانش توانایی انحلال فسفات و تحمل استرس توسط Eupenicillium parvum جدا شده از خاک گیاه چای را بررسی کردند و با بررسی دقیق تر متوجه شدند که E. parvum strain NRRL2095ITS توانایی انحلال فسفات را دارد.در سال ۲۰۰۸ Vani Mittal و همکارانش تاثیر قارچهای حل کننده فسفات سویه های (Aspergillus awamori and Penicillium citrinum) روی محصولات گیاه نخود را بررسی کردند و از بین ۶ جدایه قارچ مورد بررسی دو قارچ ذکر شده ۷% میزان محصول و ۸۷% وزن محصول را افزایش دادند.در همین سال D. Bojinora و همکارانش انحلال فسفاتهای نامحلول مراکش به وسیله ی Aspergillus niger مورد بررسی قرار گرفت و مشاهده کرد ۸/۹۴% کل P2O5 به عنوان انحلال بیشتر توسط این قارچ است. در همین سال ۲۰۰۸ Zixi chen و همکارانش فعالیت انحلال فسفات توسط سویه های phosphor bacterium ۹۳۲۰-SD مورد بررسی قرار گرفت که توانایی تبدیل اشکال نامحلول به محلول فسفات را دارد.در سال ۲۰۰۸، Hanane Hamdali و همکارانش اکتینومیست های حل کننده فسفات را از معادن فسفات مراکش جدا کردند سه جدایه شناسایی شدند که توانایی انحلال فسفات را داشتند که شامل جنس‏هایStreptomyces و Micromonospora بودند.در سال ۲۰۱۰ ماندانا بهبهانی توانایی کلونیزه شدن و رفتار زیستی باکتری های حل کننده متفاوت فسفات بومی ایران را بررسی کرد و مشاهده کرد که سه باکتری جدا شده توانایی انحلال متفاوت تحت شرایط استرس خاک های قلیایی ایران که دارای نمک و غلظت H+ بالا و دمای بالا هستند را دارا هستند.در سال ۲۰۱۰، Hanane Hamdali و همکارانش به مطالعه ی فیزیکی و آنالیز انحلال فسفات توسط اکتینومیست های جدا شده از معادن فسفات کشور مراکش و Streptomyces lividans پرداختند و به این نتیجه رسیدند که سویه های MPM و صخره های فسفاتی می توانند به عنوان bio-phosphate fertilizer رشد گیاه در محیط را پشتیبانی کنند.در سال ۲۰۱۰، Rachanajain و همکارانش در مطالعه ای Aspergillus awamori را برای انحلال متفاوت در تخمیر و سیستم گیاه – خاک مورد ارزیابی قرار دادند و به بررسی انحلال TCP و URP و آنالیز تاثیر آنها روی رشد گیاه پرداختند که مشخص شده تلقیح قارچ اثرات مفیدی روی رشد گیاه دارد.همچنین در همین سال Jin Heepark و همکارانش جداسازی باکتری های حل کننده فسفات و توانایی رسوب دادن توده سرب توسط آنها در خاک را بررسی و مشاهده کردند که PSB ها توانایی تحریک رشد گیاهان و رسوب کردن pb را در خاک های آلوده به سرب دارند PSB جدا شده Enterobacter sp. بود که به عنوان سویه موثر انتخاب شده است.در سال ۲۰۱۲ Kumar و همکارانش به جداسازی باکتری های تحریک کننده رشد گیاه پرداختند و مشخص شد باکتریهای جدا شده توانایی انحلال فسفات و تولید آمونیوم، ایندول استیک اسید، سیانید هیدروژن و ACC دآمیناز را دارند. الف) تاثیر تلقیح باکتری های حل کننده فسفات (PSB) روی رشد باکتری ها بررسی تاثیر میکروارگانیسمهای حل کننده فسفات بر رشد گیاه و جذب فسفر با آزادسازی فسفات از سنگ فسفاتی[۲۳] برای اولین بار در سال ۱۹۴۸ توسط Gerretson اعلام شد، که نتایج نشان دادند که تلقیح PSBها باعث رشد بهتر گیاه می شوند، بعد از آن گزارشات مختلفی در زمینه تاثیر PSBها روی رشد و افزایش محصول گیاه منتشر شدند.در سال ۱۹۵۶،Uarova ، تاثیر PSBهای حل کننده تری کلسیم فسفات به روی بذر را بررسی کرد و گزارش کرد که این مسئله می تواند سبب افزایش جذب فسفر و محصول گندم شود.در سال ۱۹۶۳ تاثیر باکتری Bacillus megaterium بر افزایش محصول و جذب فسفات بر روی گیاه گوجه فرنگی توسط Sundara Rao و همکاران مورد بررسی قرار گرفت.در سال ۱۹۶۹ Taha و همکاران گزارش کردند که Bacillus megateriumو PSB ها موجب افزایش وزن خشک گیاه می شوند. Karimandan و Gaur در سال ۱۹۷۱ نشان دادند که تلقیحPseudomonas spp. می تواند باعث افزایش وزن خشک، جذب فسفات و بازده محصول گیاه ذرت شود .Bajpai و Sundara Rao در سال ۱۹۷۱ دریافتند که جذب فسفر توسط گیاه در تیمار Phospho bacteria+Rock phosphate+FYM[24] بیشتر از تیمار FYM+ Rock phosphate است. Gaur و Ostwal در سال ۱۹۷۲ گزارش کردند که تلقیح Bacillus polymyxa به تنهایی با Rock phosphate باعث افزایش جذب فسفر و بازده محصول گندم می شود.در این بررسی تیمار Bacillus polymyxa+ Rock phosphateاز تیمار سوپرفسفات+ Bacillus polymyxaبهتر عمل کرد. Ralston و Bridge در سال ۱۹۷۶ گزارش کردند که افزایش رشد بذر گیاه کاج در خاک حاوی کلسیم فسفات در نتیجه تلقیح میکروارگانیسمهای حل کننده فسفات حاصل می شود.Khalafallah و همکاران در سال ۱۹۸۲ در شرایط آزمایشگاهی رشد vica faba در خاک آهکی و کود دهی در سه سطح سوپرفسفات با تلقیح PSB را بررسی کرده و نتایج نشان دادند نیمی از سوپرفسفات معمول بکار برده شده در مقابل سوپرفسفات معمول همراه با PSB رشد بیشتری برای گیاه در پی دارد. Kuccy در سال ۱۹۸۷ گزارش کرد که میکروارگانیسمهای حل کننده فسفات باعث افزایش جذب فسفر و رشد گیاهان مختلف می شود.نتایج نشان دادند که جذب فسفر از سنگ فسفات بیشتر از سوپرفسفات است.در سال ۱۹۹۲ Singh و Kapoor گزارش کردند تلقیح بذر mung bean با PSB باعث افزایش جذب فسفر و تولید ماده خشک می شود.در سال ۱۹۹۷، Defreitas و همکاران تاثیر PSB را به روی رشد گیاه کانولا و جذب فسفر توسط آن بررسی کردند و گزارش کردند که به میزان قابل توجهی جذب فسفر، ارتفاع گیاه و محصول آن افزایش می یابد.در سال ۱۹۹۷، Maheshkumar گزارش کرد که تلقیح Pseudomonas sp. به عنوان حل کننده فسفات و Azospirillum sp. به عنوان تثبیت کننده نیتروژن باعث افزایش رشد ریشه، ساقه و وزن خشک گیاه می شود.Sharma و Namdeo در سال ۱۹۹۹ در مقیاس آزمایشگاهی رشد ریشه و ایجاد گرهک را در تلقیح PSB به روی بذر سویا بررسی کردند. نتایج نشان دادند که Rhizobium+PSB+FYM می توانند بیشترین تاثیر را داشته باشند. Dubey در سال ۲۰۰۰ نشان داد که کاربرد سنگ فسفات یا سوپرفسفات همراه PSB در بذر سویا باعث شد که P2O5 به میزان Kg/ha 30 با Pseudomonas striata به تنهایی و یا Pseudomonas striata+Aspergillus awamori با هم همراه با Kg/ha 60 P2O5 در مقایسه با کاربرد سوپرفسفات کارآمدتر بوده است. همچنین وی در سال ۲۰۰۱ گزارش کرد که با کاربرد سوپرفسفات+ PSB باعث افزایش وزن خشک گیاه می شود. همچنین نتایج نشان دادند که تاثیر Kg/ha 30 ، P2O5 با تلقیح PSB بیشترین تاثیر مثبت را بر روی رشد گیاه دارد. Singh و همکاران در سال ۲۰۰۲ گزارش کردند که تلقیح همزمان Pseudomonas striata و Aspergillus awamori و کاربرد Kg/ha 30 ، P2O5به عنوان سوپرفسفات تاثیر مناسبی بر رشد گیاه و بازده محصول گندم دارد.Sharma در سال ۲۰۰۳ عنوان کرد که تلقیح PSB همراه با سنگ فسفات در مقایسه با بهره گرفتن از سنگ فسفات به تنهایی موجب افزایش بازده محصول جو می شود. Sharma و Agarwal در سال ۲۰۰۳ در بررسی مقیاس مزرعه گزارش کردند که تلقیح PSB در مقایسه با نمونه شاهد بدون تلقیح تاثیرات بیشتری در رشد گیاه و افزایش بازده محصول دارد. ب) تاثیر سطوح تلقیح روی بقا میکروارگانیسم روی بذر Brockwell در سال ۱۹۶۲ تاثیر مواد گلوله ای شکل در چسبندگی و مقاومت و بقای تلقیح و همچنین تشکیل گرهک و رشد گیاه را مورد بررسی قرار داد.وی دریافت که بذر پوشیده شده با چسب+blood+dolomite و یا چسب+blood+dolomite و بذر پوشیده شده با صمغ عربی و تلقیح شده به peat و به شکل گلوله درآمده قبل از هفته چهارم نه تنها زیان آور نیست بلکه تاثیر مثبتی روی rhizobia تلقیح شده دارد. در سال ۱۹۷۶، Philpotts در بررسی استفاده از filtermud به عنوان حامل برای ریزوبیوم، نشان داد که تلقیح بذر با این حامل و تعداد بالای ریزوبیوم در دمای C°۸ برای ۱۰ هفته، هیچ کاهش تعدادی نشان نمی دهد. Robert و Peterson در سال ۱۹۸۲ گزارش کردند که تلقیحاتی با پایه روغنی، باعث افزایش بقای ریزوبیومها روی بذر در مقایسه با تلقیحاتی با پایه peat می‏شوند. Subbaroo در سال ۱۹۷۹ گزارش کرد که سایز بذر و ترکیبات شیمیایی حامل نقش مهمی در بقا دارند.همچنین وی عنوان کرد، بین سایز بذر و تعداد باکتری در هر بذر و وزن تلقیح در هر هکتار رابطه وجود دارد. تحقیقات نشان دادند که هرچه سایز بذر بزرگتر باشد، باکتری های بیشتری در سطح آن باقی می‏مانند. ۲-۲- هدف پژوهش هدف از این پژوهش بررسی تاثیر spp. Streptomyces جدا شده از خاک بر انحلال فسفات به منظور تولید کود زیستی فسفاته می باشد. فصل سوم: روش اجرای تحقیق ۳-۱- تهیه کشت جوان و اطمینان از خالص بودن سویه نگهداری شده سویه مورد نظر را که قبلا در لوله های درپیچ دار و حاوی محیط کشت TSA نگهداری شده است را با بهره گرفتن از لوپ و تحت شرایط استریل و در مجاورت شعله و در زیر هود بیولوژیک بر روی محیط کشت نوترینت آگار کشت مجدد دادیم و به مدت ۴۸ ساعت در انکوباتور ۳۰ درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری گردید و بعد از ایجاد کلنی، آنها را به لحاظ مورفولوژیکی و میکروسکوپی بررسی کرده و رنگ آمیزی گرم از نمونه انجام شد و از تکنیک کاور اسلیپ[۲۵] برای مشاهده میکروسکوپی آن استفاده شد (توحیدی و همکاران ۱۳۹۱، ۵۵). ۳-۱-۱ رنگ آمیزی گرم برای این منظور ابتدا از نمونه باکتری مورد نظر لام فیکس شده تهیه و پس از تهیه گسترش، روی آن چند قطره کریستال ویوله ریخته و پس از یک دقیقه شستشو داده و روی لام لوگل ریخته و پس از یک دقیقه لام را شسته و سپس روی لام الکل ریخته و بلافاصله پس از ۱۰-۱۵ ثانیه لام را شستشو داده و در نهایت محلول سافرانین را به مدت ۳۰-۶۰ ثانیه روی لام ریخته و سپس آن را کاملا شسته و خشک کرده و در نهایت با میکروسکوپ با عدسی ۱۰۰ مشاهده شد (Rai 2006, 21). ۳-۱-۲ تکنیک کاور اسلیپ بر روی یک پلیت حاوی محیط نوترینت آگار سویه مورد نظر را به صورت دو خط افقی در بالا و پایین پلیت کشت می دهیم و یک لامل استریل شده با الکل را طوری بر روی یکی از خطوط کشت قرار می دهیم که یک لبه لامل دقیقا بر روی خط کشت قرار گیرد و لبه دیگر آن بر روی سطح محیط کشت قرار گیرد، باکتری در اثر رشد بر روی محیط و در اثر تماس با لامل بر روی لامل نیز رشد می کند. بعد از ۴۸ ساعت گرمخانه گذاری در ۳۰ درجه سانتی گراد، لامل را روی لام قرار داده و رنگ آمیزی گرم می کنیم و با میکروسکوپ نوری و لنز ۱۰۰ مشاهده می کنیم (Whitlon and Baas 1992, 40). ۳-۲- پیش تست سویه مورد نظر برای اطمینان مجدد از انحلال فسفات در مقیاس آزمایشگاهی به منظور بررسی مجدد توانایی انحلال فسفات توسط باکتری جداسازی شده با بهره گرفتن از لوپ و تحت شرایط استریل و در مجاورت شعله و در زیر هود بیولوژیک از باکتری در سطح محیط PVK کشت داده شد و به مدت ۴۸ تا ۷۲ ساعت در دمای ۳۰ درجه سانتی گراد گرمخانه گذاری شد. پس از مدت زمان گرمخانه گذاری باتوجه به ایجاد هاله در اطراف کلنی باکتری توانایی انحلال فسفات مورد بررسی قرار گرفت (توحیدی و همکاران ۱۳۹۱، ۵۶). ۳-۲-۱ محیط کشت[۲۶]pvk جدول ۳-۱- ترکیبات محیط کشت PVK مواد تشکیل دهنده گرم در لیتر عصاره مخمر ۵/۰ دکستروز ۱۰